不同来源乳中乳铁蛋白含量的高通量毛细管凝胶电泳检测

路梦凡，孙娜娜，李香云，李汉芳，徐丹，徐秦峰

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院国家羊乳制品加工技术研发专业中心，西安 710021；2.西安喜洋洋生物科技有限公司，西安 710021）

0 引 言

乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是一种活性蛋白[1-4]，已广泛添加在婴幼儿配方食品和保健品中[5-7]。在不同物种来源乳中LF的含量差异很大，并且受加工工艺影响[8-10]。因此检测各种特色乳品中LF的含量对其营养价值的评估十分有必要。

目前，已经建立了多种牛源LF的检测方法[11-14]。其中，高效液相色谱法可以用来测定不同来源乳中LF的含量[9,15-18]，但由于其对样品的纯度要求较高，需用肝素亲和柱对样品进行前处理，并且经纯化后的生鲜羊乳和人乳样品，其他蛋白依然存在干扰[9]。同样地，高效液相色谱与质谱联用也能够对不同来源乳中的LF进行分析[19]，但设备昂贵，对操作人员要求较高，缺少广泛地适用性。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法电泳分离，也可以半定量不同来源乳中LF含量[20]，但该方法每次检测的样品数量有限，操作繁琐且耗时长。因此，目前仍缺少快速、简便、高通量、无需复杂样品前处理的，具有普适性的不同来源乳中的LF含量检测方法。

本研究在前期建立的全自动高通量毛细管凝胶电泳检测牛源乳铁蛋白（bovine lactoferrin，BLF）的基础上[21-22]，通过筛选分别能够与人源乳铁蛋白（human lactoferrin，HLF）、羊源乳铁蛋白（goat lactoferrin，GLF）特异性结合的DNA序列，将方法进一步拓展到了HLF、GLF的定性定量检测，验证了该方法的普适性，为不同来源特色乳中LF含量检测提供新方案。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

DNA1[23]（5'-TCC ATG ACG TTC CTC TCC ATG ACG TTC CTC TCC ATG ACG TTC TTC CTC-3'）、DNA2[24]（5'-AGG CAG GAC ACC GTA ACC GGT GCA TCT ATG GCT ACT AGC TCT TCC TGC CT-3'）、DNA3[25]（5'-TAG AAG ATC AAA-3'），由上海生工生物工程公司；DL500 bp DNA marker（Takara），100×TE缓冲液以及磷酸盐缓冲液PBS（Sigma-Aldrich），人源乳铁蛋白（human lactoferrin，HLF）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、α1-抗胰蛋白酶（α-antitrypsin from human plasma，AAT）、纤维蛋白原（Fibrinogen from human plasma，Fib）、血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、α-乳白蛋白（α-lactabumin，α-Lac）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）、酪蛋白（Casein），Sigma-Aldrich；羊源乳铁蛋白（goat lactoferrin，GLF），西安优博（YOB IOS）；全自动高通量毛细管凝胶电泳仪器（Qsep1）及卡夹台湾光鼎（Bioptic）公司。

1.2 实验材料

实验中所用到的母乳来源于自愿参加此研究的志愿者，羊奶粉购于西安市某超市，液态乳样品冰箱4℃储存待用，奶粉样品常温储存待用。

1.3 检测方法

DNA序列处理：实验中的DNA序列由1×TE缓冲液溶解至100μmol/L，1×PBS稀释至1μmol/L。为获得具有功能性的DNA序列的二级结构和三级结构，使用前对DNA序列进行95±0.5℃，5 min退火处理，冰箱-20℃下2 min冷却待用。

选取出的非标记-DNA序列（0.5μmol/L）加入浓度梯度（0～150μg/mL）HLF（1 mg/mL），加入1.0μL 20×PBS，加入超纯水至最终体系为20μL，混匀孵育30 min后进行全自动毛细管凝胶电泳检测。GLF的样品检测浓度为0～25μg/mL。

全自动毛细管凝胶电泳检测参数为：LED激发光源：480 nm；检测器：PMT荧光检测器；进样电压：4 k V；进样时间：10 s；分离电压：8 k V；分离时间：240 s；毛细管的有效分离长度为13 cm。

琼脂糖凝胶电泳检测：样品中加入2μL SYBR Gold染料（20×）以及3μL上样缓冲液（6×）后进行电泳。电泳参数：1%的琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，电压为100 V，电泳时间为30 min。电泳结束后使用蓝光透射仪观察电泳结果。

1.4 实际样品检测

实际样品前处理：新鲜母乳在4℃，12 000 rcf离心处理10 min，取中间层；婴幼儿奶粉溶解方式为称取1 g奶粉用超纯水定容至7 mL，4℃，12 000 rcf离心处理10 min，取中间层。

实际样品检测：用所建立的检测HLF、GLF的方法，分别检测新鲜母乳（取0.5μL）、婴幼儿奶粉（取3μL）中LF含量。在实际样品中加入LF标准品进行加标回收检测。

2 结果与分析

2.1 人源乳铁蛋白的毛细管凝胶电泳检测

在凝胶电泳迁移实验中，选取合适的DNA序列对LF检测的成功实现至关重要。在前期LF检测中采用的是针对牛源LF的特异性DNA结合序列[21,24]，但是由于人LF和牛LF的蛋白质氨基酸序列仅具有69%的同源性，因此，DNA序列筛选实验中增加另外两种能与HLF特异性结合的DNA序列（DNA2、DNA3）[23,25]。由于毛细管凝胶电泳迁移实验中无法观察到复合物的电泳峰[21]，采用琼脂糖凝胶电泳表征了上述3条DNA序列用于HLF检测的可行性。实验结果如图1（a）所示，3条DNA序列在高浓度HLF存在时，均能够观察到明显的复合物条带，但是对于低浓度HLF，只有DNA1和DNA2能够出现复合物条带，并且DNA2在高浓度HLF时，观察到二聚体条带，影响HLF的准确定量，因此选用DNA1进行HLF的毛细管凝胶电泳检测。

由于毛细管凝胶中已经包含了DNA染料，本实验中直接采用了非标记的DNA序列，相比于之前采用的荧光标记DNA[21]，显著降低了检测试剂成本。将上述选取的DNA1序列分别和不同浓度的HLF标准品孵育后进行毛细管凝胶电泳检测，结果如图1（b）所示。不同浓度的HLF与DNA1序列混合的样品及阴性样品均出现DNA1序列的峰。由于HLF和DNA1序列特异性结合，导致体系中剩余的游离DNA1序列减少，含有HLF的样品的游离DNA信号和峰面积明显低于不含HLF的样品，与前期BLF检测实验结果一致[21]。验证了采用非标记DNA序列进行HLF定量检测的可行性。

当增加HLF的浓度时，观察到了预期的游离DNA1电泳峰高降低图1（b）。以HLF的浓度（μg/mL）为横坐标，游离DNA1的峰面积为纵坐标绘制工作曲线，线性范围0～150μg/mL，检出限11.74μg/mL图1（c）。特异性实验结果如图1（d）所示，只有含HLF的样品和DNA1序列特异性结合使得游离DNA1序列的峰面积明显减少。因此，所建立的毛细管凝胶电泳方法能够用于HLF含量的特异性定量检测。

图1 HLF毛细管凝胶电泳检测的DNA序列选择（a）、线性范围（b）、（c）和特异性（d）

2.2 羊源乳铁蛋白的毛细管凝胶电泳检测

采用同样的方式验证了GLF的毛细管凝胶电泳检测的可行性，实验结果如图2所示。与HLF不同，3条DNA序列中，DNA2对于低浓度GLF复合物电泳条带现象最明显图2（a），因此后续选用DNA2序列用于毛细管凝胶电泳检测GLF。随着GLF浓度的增加，游离DNA2序列峰的面积减少，浓度在0～25μg/m L的范围内均具有良好的线性图2（c），计算获得检出限3.53μg/m L，低于HLF的11.74μg/mL，表明该方法对于GLF具有更高的检测灵敏度。同时，该方法也具有良好的特异性图2（d）。

图2 GLF毛细管凝胶电泳检测的DNA序列筛选（a）、线性范围（b）、（c）、特异性验证（d）

2.3 实际乳品样品检测

为验证本研究建立的毛细管凝胶电泳法检测HLF、GLF的实用性，采用上述建立的方法对母乳及羊奶粉中的LF含量进行检测，检测结果见表1。新鲜母乳中LF的检测值为3.25 mg/mL，且加标回收率为107.45%，与文献报道相符[10]。羊奶粉中未检出GLF，分别添加1、3、5μL羊乳铁蛋白标准品（0.1 mg/m L），测得加标回收率为85.5%～114.9%。表明本研究建立的毛细管凝胶电泳可用于实际样品中不同来源LF的简便、快速、准确检测。为添加LF的婴幼儿配方奶粉以及特色乳营养价值评价提供一定的技术参考。

表1 实际样品中乳铁蛋白的检测结果

3 结 论

本实验建立的毛细管凝胶电泳快速检测HLF和GLF的方法，可实现母乳及羊奶粉等实际样品中不同来源LF的定量检测，提高了该方法的通用性。实验中只需简单的离心除脂以防止毛细管发生堵塞，不需要复杂的样品前处理过程，简化了操作，同时减小了样品前处理过程中引入的误差；用非标记DNA序列取代荧光标记的DNA序列，降低了检测成本。本方法准确度高，重现性较好，适合工厂大批生产婴幼儿配方羊奶粉及其它奶制品等添加LF含量的测定。同时，本方法用于多种特色乳源中LF的定量检测具有很好的应用前景。