肿瘤患者个体化治疗药物筛选技术研究进展

伍晓晓 刘美佑 彭莉 程梁华 王番 王婧雯 贾艳艳

(中国人民解放军空军军医大学第一附属医院药剂科,陕西 西安 710000)

2021年1月《临床医师癌症杂志》发表的最新全球癌症统计报告中指出,2020年中国癌症新发病例4 568 754例,死亡病例3 002 899例,约占该年全球癌症发病和死亡总数的23.7%和30.2%[1]。目前癌症治疗方案包括传统的手术治疗、放射治疗、化学治疗和近年来发展迅速的靶向治疗、免疫治疗等新型治疗方式[2]。由于不同肿瘤组织生物学特征不同,对化疗药物敏感性也存在巨大个体化差异,仅凭经验式化疗而忽略个体差异往往使得总体疗效不佳。近年来,随着肿瘤精准医疗概念提出,各种肿瘤精准治疗技术应运而生[3]。发展能够及时、直接、准确反映肿瘤患者药物敏感性的辅助检测技术,是肿瘤精准医疗的研究热点之一。

目前被国内外研究最多的肿瘤患者个体化用药筛选方法有:①患者基因组信息分析技术;②类器官培养;③患者源性肿瘤样细胞簇(PTC)模型;④胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST);⑤人源性肿瘤异种移植模型(PDX);⑥迷你人源性肿瘤异种移植模型(MiniPDX)。本文对这些方法进行分析,以阐明各项技术的优缺点及其应用范围和最新进展,并比较它们作为癌症研究中的临床前模型的前景和挑战,该综述对于肿瘤患者个体化用药的研究及应用都具有较强的前瞻性和指导性作用。

1 患者基因组信息分析技术

患者基因组信息分析技术是通过检测患者生物样本中的基因突变、基因单核苷酸多态性分型及其蛋白表达状态来预测药物疗效和评价预后,指导临床个体化用药,以减轻患者不良反应,改善疗效,促进医疗资源的合理利用。该方法的流程为通过解读基因大数据,获取与疾病相关的变异,找到致病基因,制定个体化用药方案。优势是检测范围广、准确性高;样本不仅仅局限于细胞或者组织,还可以通过提取血液或体液中DNA的方式进行检测;且使用基因芯片法通量高、花费时间短。该技术不足之处是成本较高,有些基因检测技术需要特殊设备;肿瘤不断产生基因变异,难以找到真正的驱动突变,即使找到明确的突变,单药靶向治疗可能也只是短暂起效;且发现的生物标志物很难转化为有效的个体化用药方案[4]。

目前基因测序数据分析时间正在逐渐缩短,WHEELER等[5]首次通过新一代高速测序技术在2个月内完成了单人二倍体基因组DNA序列测序,而30X人类全基因组胚系变异分析技术仅用7 min即可完成一份可供参考的人类全基因测序报告。由于药敏预测是基于基因检测得出的结果,且大部分结论仅由相对大样本的关联分析得出,并未考虑肿瘤除基因驱动外,还有表观遗传改变、细胞系特异性及非癌因素等复杂性,故对于存在相同生物标记物或基因突变位点的肿瘤,使用同种药物也会出现不同治疗反应。JAMA上最新报道的研究结果表明,仅约30%的患者对于依照基因组信息分析选择的药物治疗存在反应[6]。因此,根据肿瘤患者的基因组信息筛选最有效的药物并不能很好地实现肿瘤个体化精准治疗,但患者基因组信息分析仍可为肿瘤患者的药物治疗选择提供重要参考依据。

2 类器官培养

类器官是一种由干细胞直接诱导形成的三维组织模型,属于近年来新出现的临床前模型[7]。类器官与对应真器官拥有高度相似的组织学特征,具有自我更新和自我组织能力,可在一定程度上模拟器官的功能,因此成为从基础发育、干细胞研究到个体化医学研究等领域应用的优秀模型[8]。类器官药敏试验的流程为获取肿瘤组织,体外类器官培养并且进行给药,利用生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA)进行药敏检测,获得其检测结果,试验周期14～28 d。类器官培养具有传统肿瘤细胞系及转基因小鼠等模型无法比拟的优势,具有稳定的表型和遗传学特性[9];可以大规模培养和高通量药物筛选;可以培养各种组织和器官,包括肠道(小肠/结肠)、胃、肝脏、心脏、肺、前列腺、胰腺、肾脏、乳腺、脑类、视网膜以及内耳等[10-12];肿瘤基因表达谱可以在长期培养中保持稳定,并能更好地模拟肿瘤缺氧微环境[13-14]。肿瘤类器官在模拟人体肿瘤方面的保真性,使得其在肿瘤个体化治疗、新药研发方面具有广泛的应用前景[15]。但类器官的不足之处在于传代次数有限,成熟度低,缺乏基质、免疫细胞以及血管等结构[16];还有某些肿瘤亚型培养技术复杂,成功率低[17]。

目前,类器官被大量应用于临床研究,如对类器官进行基因分析,研究基因表达谱的变化,有助于发现疾病病因以确定治疗方案。应用类器官进行药物筛选,首先是靶向药物的应用,然后是免疫治疗的应用[18]。作为一种新兴的临床前模型,改进后的类器官能够进一步用于肿瘤发生以及药物耐药机制的研究和药物筛选,有助于实现精准的个体化医疗目标[19]。

3 PTC模型

PTC模型由肿瘤干细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等多种细胞组成。PTC模型在结构和功能上类似于原始肿瘤,能够很好地呈现肿瘤组织本身的多细胞微环境与肿瘤上皮细胞的相互作用。该方法的工作流程为获取肿瘤组织标本,将组织切碎并使用消化液消化,加入培养基和基质胶进行微肿瘤PTC模型构建,然后用高通量测试芯片检测模型的药物敏感度。微肿瘤PTC模型在培养时间和细胞组成等方面具有明显优势,可以非常快地在体外形成用于实验的微肿瘤PTC结构,该结构可以很大程度地保留原始肿瘤的病理特征、细胞组成特征及遗传背景特征。PTC模型采用自聚增殖的培养方式,包含巨噬细胞和成纤维细胞等基质细胞,能够很好地模拟体内微环境,能够在2周之内检测100～2 000种药物,完成个性化药物测试[20]。YIN等[21]实施PTC模型来指导1例常规治疗后复发并转移的直肠黏液腺癌患者的化疗选择,经过3个周期的非常规治疗(由PTC模型确定)后,患者治疗效果良好,淋巴结转移几乎消失,腹水体积和部分肿瘤标志物明显减少,该微肿瘤模型预测患者药效的准确性超过93%。但PTC模型也存在缺点,例如由于基质细胞的损失,PTC的药物反应模式可能在培养4周后发生变化,导致长期培养和传代困难;PTC模型的另一个缺点是,由于缺乏T细胞和内皮细胞成分,其无法检测免疫治疗药物或抗血管生成靶向药物的药效。因此PTC模型的效果还需要更大规模的临床试验进行验证。

4 CD-DST

CD-DST是1997年KOBAYASHI等[22]结合其他体外药敏检测技术优点提出的检测技术。CD-DST具有结果准确、所需细胞数少、灵敏度高、可排除成纤维细胞干扰(通过图像分析软件)、临床相关性好等特点,其缺点是体外培养无法模拟肿瘤微环境[23]。CD-DST主要过程包括制备原代肿瘤细胞悬液、胶滴内培养肿瘤细胞、药物处理、无血清培养和图像分析5部分[24]。CD-DST目前能够检测6种肿瘤,分别为非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌以及宫颈癌。CD-DST方法预测的药物敏感性结果具有很高的临床相关性,对化疗反应预测的准确率高达84.1%[25]。大量研究证实,CD-DST为提前选择敏感性较高的临床抗肿瘤药物提供了重要技术手段[26]。CD-DST目前已被开发为一种有效的抗癌药物评价系统,该培养系统模拟癌细胞所处的微环境,在体外对癌细胞进行不同化疗药物的药敏试验,可帮助患者选择最适宜药物。CD-DST被证明对抗癌药物的临床反应具有较高的预测准确性[27]。

5 PDX

PDX是目前最能代表人类肿瘤遗传信息特征的小鼠异种移植瘤模型[28],与传统细胞系异种移植模型及基因工程鼠模型不同,PDX将患者的肿瘤组织通过皮下、肾包膜下或原位种植移植到免疫缺陷小鼠体内,继而对小鼠模型进行体内系统给药,通过测量模型瘤体大小变化评价药物敏感性,获得药敏测试结果,整个过程需要90～150 d[29-30]。PDX模型不仅可以保留肿瘤的异质性,还能保留原代肿瘤的组织形态学特征、基因表达特征、转移能力、标志物、激素反应能力和药物敏感性等多种特性,为肿瘤患者的药物筛选及疗效提供更精准的预测[31]。研究表明,PDX对传统化疗药物有效率和耐药率的预测准确度可达90%和97%[32]。

PDX具有良好的应用前景,适用于癌症异质性分析、药物筛选、个体化治疗和复发分析[33]。然而其也存在不足之处,如建模成功率低、耗时、昂贵;基质丢失;软硬件要求及成本高;存在伦理问题;小鼠的免疫系统与人类差异较大,使得PDX不能反映人体免疫与肿瘤间的相互作用;宿主与原发灶环境不同导致肿瘤细胞进化方向和转移特征发生改变;面对器官和部位来源繁多的恶性肿瘤,PDX的肿瘤接种部位(主要在皮下组织与肾包膜下)不能准确代表原发瘤的周围环境等[34]。上述缺点阻碍了PDX的广泛应用,因此有必要对PDX进行改进。

6 MiniPDX

MiniPDX药敏检测技术是目前专门针对肿瘤患者临床一线治疗需求特点研发的新技术[35]。该技术可体外分离肿瘤标本原代肿瘤细胞,体内进行药敏试验,即将新鲜的肿瘤组织细胞经特殊方法制备后,放入微胶囊(由中空纤维膜制成,经皮肤小切口植入皮下),然后以系统给药的方式 (口服灌胃、静脉注射、腹腔注射等)连续数次给药后,取出微胶囊,进行ATP-TCA药敏检测[36]。MiniPDX药敏检测技术同时具有体外肿瘤药敏试验周期短和体内药敏试验与临床疗效一致性高的优点,可在7～10 d内获得关于患者化疗药物敏感性的试验结果[37]。MiniPDX能够维持肿瘤的异质性,检测周期短、准确性高、费用低,其适用肿瘤标本类型多(包括腹水标本)。该技术能够满足肿瘤患者一线精准治疗药物选择的迫切需求,并具有广阔的临床应用前景。有研究显示,对MiniPDX和PDX药效相关验证数据表明,MiniPDX与PDX的相关性为92%[38]。虽然MiniPDX有许多优点,但它不可避免地存在一些局限性[39]:①MiniPDX模型不可再生,需要持续采集新鲜的肿瘤组织样本;②MiniPDX中的药物仅使用5～7 d,在研究药物的不同使用周期时,MiniPDX将无法模拟实际给药和效果。③MiniPDX将肿瘤组织分离成单细胞悬液,可能破坏细胞间的结构,会对肿瘤微环境产生一定影响;④微胶囊从空间上限制了肿瘤细胞的迁移和侵袭,故不能用于肿瘤转移和侵袭相关研究。尽管存在上述缺点,但MiniPDX耗时短、成本低,且能准确预测患者的药物疗效。因此在目前的肿瘤患者个体化用药筛选模型中,MiniPDX仍具有突出优势。

7 目前已开发的肿瘤患者个体化用药筛选试剂盒

7.1 ATP-TCA试剂盒

ATP-TCA通过荧光酶与荧光素结合,催化ATP转变为AMP,通过释放出的荧光测定细胞内ATP含量来反映活细胞数量,比较不同药物浓度对细胞的抑制率,从而评估该药对肿瘤细胞的杀伤效果。ATP-TCA敏感性高,检测速度快,完成ATP检测仅需30 min,标本可评价率在90%以上;精密度好,变异系数小于10%;可高通量检测,自动化程度高且稳定性好[40]。国内很多公司都已生产出ATP-TCA试剂盒并投入使用。

7.2 CD-DST试剂盒

CD-DST具有很多优点,如需要的肿瘤组织少、标本评价率高、实验重复性好、体外实验结果与临床疗效符合率较高等,在临床及基础研究,以及肿瘤患者化疗方案制定中的应用已获得肯定。目前该试剂盒在日本已得到广泛应用。

8 结语与展望

随着精准医学的发展,肿瘤个体化治疗是临床亟需解决的瓶颈问题。2014年,国家药品监督管理局等机构批准了高通量测序技术在基因测序产前筛查与诊断、胚胎植入前遗传学诊断等生育健康领域的临床应用试点。同年,高通量测序技术被批准在肿瘤的诊断和治疗上进行临床试点。随着国家对精准医学的大力扶持,肿瘤个体化用药技术会不断发展和改善,同时分子靶向药物研发的速度也在加快。虽然上述技术在肿瘤患者个体化用药中均有独特潜力,但其应用也有一定局限性。因此,我们还需运用各类肿瘤预测模型来检测肿瘤患者治疗药物间相互作用,以及疾病的分子靶点及其与免疫系统间相互作用,以求为肿瘤的精准用药提供技术支持。同时可以将技术产业化,开发试剂盒,用于临床肿瘤患者的个体化用药筛选。

作者声明：伍晓晓、贾艳艳和王婧雯参与了研究设计;伍晓晓、刘美佑、彭莉、程梁华和王番参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文,且均声明不存在利益冲突。