植物花粉影响因素和保存方法研究进展

王 慧，张从合，黄艳玲，汪和廷，方 玉，杨 韦，管昌红，杨 力，王 林，严 志

（1安徽荃银高科种业股份有限公司/农业农村部杂交稻新品种创制重点实验室，合肥 230088；2上海中科荃银分子育种技术有限公司，上海 200233）

0 引言

花粉是植物种质的主要形式之一，具有丰富的遗传多样性[1]，在植物有性繁殖中发挥着非常重要的作用，也是植物遗传、杂交育种和种质资源保存工作中最重要和最基础的材料。但是大部分植物花粉在离体状态下的寿命都很短，不利于植物的遗传研究，同时也给杂交育种和种质资源研究工作带来很大难度。

将植物花粉进行集中收集，在特殊的条件下进行花粉保存研究，延长花粉寿命，对于农业产业特别是提高育种进程，克服杂交制种花期不育或花时不同步，提高土地利用率，提高机械化水平，完善种质资源的保存等都具有非常重要的价值。花粉活力是植物正常受精结实的关键因素之一，花粉能否保存成功关键在于花粉活力的保持，1922年KNOWLTON等[2]最早报道了将金鱼草花粉储藏在超低温(-180℃)后仍然具有一定的活力后，花粉保存研究日渐兴起。据统计，国内外对花粉不同保存方法和保存技术的研究已从最初的果树、主要农作物发展到园林植物、经济林木、药用作物等170多种植物材料，并开展花粉活力测定方法对花粉保存效果的检验，同时也有利用保存的花粉成功应用于杂交育种研究的报道[3-11]。为了完善种质资源保存方法及加速育种进程，本文通过整理上述研究，阐述了影响植物花粉生活力的主要因素、花粉生活力测定方法、花粉的收集及植物花粉的主要保存方法，以期为进一步研究不同植物花粉的长期高效保存提供参考依据。

1 影响花粉生活力的主要因素

花粉的生活力通常指维持受精时间长短的能力，影响花粉生活力的因素很多，植物花粉本身的基因型、花粉类型和遗传特性决定了不同植物花粉的生活力不同；此外，温度、湿度、光照和气体成分等外在因素也会对花粉生活力产生很大影响。

1.1 花粉类型对花粉生活力的影响

花粉的类型、结构及所含的化学物质对花粉生活力影响较大，成熟花粉的壁内面包含一个营养细胞和一个生殖细胞或由生殖细胞产生的两个精子。根据花粉成熟时所含的核数目，被子植物的花粉分为二核型、三核型以及兼具两种花粉类型的混合型花粉。前人对265科植物花粉的观察并分类得出，包括豆科、茄科、百合科、石蒜科等179科属于二核型花粉；包括禾本科、十字花科、菊科等54科属于三核型花粉；其余32科为混合型花粉[3,12]。

一般认为三核型花粉活力丧失速度是二核型花粉的2倍，与二核型花粉相比寿命较短也较难保存。因此研究二核型花粉成功保存的较多[12]。关于两类花粉寿命差异的原因较多，有分析认为三核型比二核型多经历一次减数分裂，消耗了细胞质内的淀粉、脂肪等贮藏物质导致，也有认为三核型花粉外壁较薄，所以抗外界环境如干燥等能力较差，还有认为三核型花粉的代谢旺盛，呼吸强度是二核型花粉的三倍左右，因此不易保存[13]。禾本科植物中的水稻、玉米、小麦等花粉属于三核型，而木本科植物中的苹果、梨、桃等属于二核型[12]。

1.2 基因型及化学成分对花粉生活力的影响

不同物种的花粉生活力差别较大，如禾本科作物的花粉生活力在离体状态下丧失较快，水稻花粉5分钟基本全部失去活力，高粱花粉5 h基本全部失活，小麦花粉在5 h后授粉结实率仅为6.4%，玉米花粉生活力在离体状态下仅维持1～2天，瓜菜类植物花粉处于自然状态下4～5 h，花粉活力也会全部丧失[14-16]。

花粉本身是富含淀粉和脂肪及某些激素的有生命的颗粒，王金祥等[17]研究得出狼尾草相比水稻玉米花粉耐储藏是由于其蛋白质含量较高、淀粉含量较低；李要民等[18]研究几种禾本科植物花粉的生理比较表明花粉在贮藏过程中，花粉活力保存的时间长短与花粉的化学成分的变化有关，花粉活力保存较短的花粉中生长素、赤霉素、玉米素含量比活力保存时间长的花粉高，抑制生长的脱落酸含量则相对较低[19]。

同一物种不同品种间花粉生活力也有不同[20]，J.科佩等[21]研究玉米的8种不同遗传背景之间花粉的生活力差异，通过花粉采集后置于4℃下80 min进行体外萌发实验得出，8种玉米花粉的体外萌发百分比在28%～63%之间，相差两倍多；同时研究了2种水稻基因型的花粉在相同环境下20 h后，花粉萌发率相差25倍。可见基因型对花粉生活力影响较大。

1.3 环境因素对花粉生活力的影响

花粉生活力除受遗传因素影响外，受环境条件特别是温度和相对湿度的影响很大，同时，气压和气体对花粉的贮藏寿命也会产生影响。王业遴等[22]研究表明湿度是影响桃花储藏花粉生活力的主要因素，温度次之，光照影响较小。李要民等[18]研究得出低温高湿条件有利于禾本科作物花粉活力的保存，在低温(5℃)高湿(80%)条件下，水稻和玉米花粉活力分别为46.4%和83.3%。J.科佩等[21]研究在减压/减氧水平保存时，玉米花粉生活力保持时间更长，玉米最佳条件是67k～84 kPa，得出如果离体花粉在低于大气压下的状态下，在高湿度和低温储存期间的花粉生活力通常会得到改善。在不损伤离体花粉原生质的前提下，保存花粉活力的有利环境是最大限度地降低花粉的代谢活性。

2 花粉生活力的测定方法

通常用染色法、离体萌发率测定法、基于微流控芯片技术检测活力法及杂交授粉测定结实率法等检测花粉生活力，进行花粉生活力测定，选择适宜的活力检测方法显得尤为重要。

2.1 染色法

花粉染色法主要包括I2-IK法、四唑染色法（TTC法）、联苯胺染色法、FDA荧光染色法等[23-24]。其中I2-IK法是根据淀粉遇碘变蓝的深浅程度来判断花粉的活力，对于菊属植物等淀粉含量低的花粉不适宜用该方法[25]，对于细胞壁厚的花粉粒该方法染色很浅，而棉花花粉则不着色[13]。四唑染色法（TTC法）是利用无色的四唑（氯化三苯基四氮唑的简称）渗入细胞后与脱氢酶反应后的颜色来判断花粉活性，有生活力的花粉为红色。胡君艳等[26]得出TTC法测得银杏花粉的活力最接近离体萌发测的花粉活力；但是该法染色后颜色差别较小不易分辨。联苯胺染色法主要由花粉细胞壁上的过氧化物酶将联苯胺氧化成蓝褐色，进而判断花粉的活性，番茄和马铃薯等由于花粉壁缺乏过氧化物酶，用联苯胺不染色，禾本科作物的花粉用联苯胺均能着色[14]。FDA荧光染色法能测试花粉中酶活性及质膜的完整性，通过荧光染料进入原生质后，被醋酶作用形成一种能产生荧光的荧光素并根据花粉产生荧光的情况判断花粉活性[27-28]，该方法可以表征油茶花粉潜在的活力[28]，目前在国内少有报道。

2.2 离体萌发测定法

花粉离体萌发测定法是测定植物花粉活性较为直观和准确的方法，指将花粉置于特定成分的培养基上进行离体培养，通过在显微镜下观察花粉管伸长的长度来确定花粉活力的大小[13,29]。常用的培养基有液态和固态两种，均是在一定的人工控制条件下培养，但离体萌发测定法应用过程中培养基中矿质元素、营养物质以及培养温度和时间等萌发条件等都会影响花粉萌发率进而影响花粉的活力[30]，胡君燕等[31]认为固体培养基法比较适宜测定银杏花粉生活力，在培养基中添加少量的硼和钙对银杏花粉萌发有一定的促进作用。有研究表明玉米的花粉较难在培养基上萌发，石思信等[15]研究配制15%的蔗糖、0.01%的硼酸、0.03%的硝酸钙、0.7%的琼脂配制成的固体培养基可以是玉米花粉的萌发率达到74%。袁德义等[32]研究得出离体萌发法是山茶属植物花粉最为理想的快速测定法。

2.3 基于微流控芯片技术检测活力法

随着科技的不断发展，近年来快速测定花粉活力也会用到基于微流控芯片技术的花粉活力分析仪，主要原理是当细胞流经施加了高频交流电压的微电极，高灵敏传感器即刻捕捉到两电极间的阻抗变化，得到流经细胞的数量、大小、以及其他物理特征，进而快速分析出花粉活力。该方法检测缩短了样品预处理的时间，无需染色、操作简单、测定快速，并且不会破坏花粉，大大节省了科研工作者的时间及劳动支出，并可得到大量可供分析的信息和实时数据。J.科佩等[21]利用花粉活力分析仪快速分析玉米、水稻等离体花粉活力。但由于活力分析仪价格昂贵而没有被广泛应用。

2.4 杂交授粉测定结实率

杂交授粉测定结实率主要通过将花粉授予母本柱头，成熟期计算母本结实率来测定花粉的生活力，是最真实也是最具有实际应用价值的方法，在进行田间授粉时需要注意隔离母本花粉，防止其他花粉干扰，在进行试验设计时也要避免由于遗传因素导致的不亲和，该方法检测花粉活力的时间较长，也容易受到外界因素的影响。

3 花粉的采集

不同植物花粉的特性不同，花粉采集的时间、方法和季节也不同。花粉的产量和质量除了受遗传特性影响之外还会受到环境因素的限制[1]。CRADDOCK等[33]得出刚开裂的花药保存花粉效果最好。梁立等[34]研究得出成熟花粉与近成熟花粉的保存效果较好，而幼嫩花粉保存效果较差。MARCHANT等[35]则认为未开的花朵可以减少花粉污染的风险，也是可取的。通常花粉采集选择在晴朗的天气，于开花盛花期采集的数量和质量效果最好，雨天或雨后收集花药含水量太高，导致花粉结团生活力降低[29]。大多数木本科植物在中午散粉量最大，牡丹花粉根据品种特性集中在10:00—14:00采集最佳[36]，且在绽口期采集的花粉萌发率最高，采集过早，则雄蕊未完全成熟，花粉量少且积累的营养物质不足，造成花粉活力低下；采集过迟，大部分雄蕊已散粉，影响花粉采集量。禾本科植物中，水稻花粉一般在晴朗的上午10:00—11:00开花高峰期进行采集，小麦花粉适宜在10:00—12:00和15:00—18:00采集[37]。

目前花粉采集主要分为人工采集和机械采集，人工采集花粉时间较长、效率较低、采粉不均匀，且人为操作可能会使花粉活力降低较快。关于机械采集，张从合等[38-40]研究保持禾本科作物离体花粉高活力的方法及装置，可以缩短花粉采集时间，提高花粉采集效率和花粉生活力。

4 植物花粉的主要保存方法

4.1 有机溶剂保存方法

岩波洋造等[41]得出在有机溶剂中可以储藏植物花粉。猕猴桃花粉、百合属、茶梅、凤仙花等均可以保存在有机溶剂中[11]。刘武林等[42]证实了山茶、柳、杏等植物花粉在有机溶剂中保存的可行性，认为选择适宜的有机溶剂是能否应用有机溶剂贮存花粉的关键。常用的有机溶剂包括醚类、苯类、酮类、醇类等等。王郁民等[43]研究猕猴桃花粉的有机溶剂保存可行性，得出花粉在二甲苯、甲苯、苯、1-戊醇、乙酸乙酯和己烷等有机溶剂中能维持较久的生活力，但需要花粉含水量适中，中华猕猴桃和美味猕猴桃在有机溶剂中保存的适宜含水量分别为8.46%和8.71%。刘国俭等[44]将山荆子、桃、山杏3种果树新鲜干燥花粉分别浸于丙酮、苯、二甲苯和乙酸乙酯4种有机溶剂中保存1天后都具有正常花粉的授精坐果能力。至今为止，用有机溶剂长期保存花粉的技术还鲜有报道。

4.2 低压保存方法

通过提高CO2浓度，降低O2浓度有利于植物花粉的保存[11]，王金祥等[45]通过研究在不同分压CO2和O2条件下，水稻、玉米和狼尾草花粉的活力，得出含2×104PaCO2的气体条件有利于3种花粉的贮藏。李瑞嘉等[46]进行杏花粉的低压保存研究，得出在5℃±2℃和79.7 kPa的低压环境下可有效保存花粉1年。

4.3 低温保存方法

低温能够明显的延长花粉的寿命，低温可以降低花粉呼吸强度和酶活性，一般来说，温度越低，花粉保存的时间越长[11]。杨帆等[47]研究得出澳洲坚果花粉在4℃冰箱中保存30天，其萌发率仍然有10.79%。陈雅等[28]采用低温(4℃)储藏油茶“三华系列”花粉30天以上，花粉活力保持在40%～70%。胡君燕等[22]得出4℃冰箱干燥保存利于保持银杏花粉生活力。陶丽等[48]研究澳洲坚果花粉的储藏方式，认为4℃、湿度50%人工气候箱贮藏花粉5天后的花粉萌发率与对照相当，贮藏效果最好。小麦花粉在3～4℃低温环境下保存两周后依然有很好的授粉结实率。而张保才等[49]认为低温干燥法有利于保持辣椒花粉的活力，在4±1℃低温环境下，干燥处理较未干燥处理延长20天左右。

4.4 超低温保存方法

目前普遍认为最长久保存花粉的方法是超低温保存。1922年KNOWLTON等[2]最早报道了将金鱼草花粉储藏在超低温(-180℃)后仍然具有一定的活力。江雨生等[50]首次将桃、梨4个品种的花粉在超低温储藏365天，研究花粉的授粉结实率、离体萌发率等与新鲜花粉进行比较，均无明显差异。王琳等[51]研究扁桃花粉可在超低温环境下保存，且保存后仍具有较高的活力。王彩虹等[52]对杏的两个栽培种花粉的低温和超低温储藏进行了研究，得出在适宜含水量下两种温度保存一年后花粉的授粉结实率变化不大。陈霜莹等[53]进行了39个树种包括苹果、梨和桃等花粉的超低温保存。张金梅等[54]研究得出桃花花粉在超低温下可保存至少4年。相关研究报道美国山核桃的花粉可超低温保存长达10年时间[55]。目前已经实现了鳄梨、巴旦木、桃、梨、杏、李、核桃、葡萄、枇杷、榆叶梅和海棠等果树作物的花粉超低温保存。

在农作物花粉的研究中，石思信等[15]得出玉米花粉经超低温保存1～2年后授粉有结实；孙果忠等[16]研究得出花粉含水量在11.3%～14.7%范围是玉米花粉超低温保存成功的关键。胡晋等[14]研究水稻花粉超低温保存7天后依然有一定的活力，得出花粉含水量在9.11%和13.24%含水量较适宜水稻恢复系花粉的超低温保存。张保才等[49]将辣椒花粉在超低温贮藏1年后仍具有较高的花粉生活力。李秉玲等[56]研究17个芍药品种花粉超低温保存方法，得出花粉在经超低温保存4年后仍具有较高的萌发率，用其授粉可获得种子。常维霞等[57]得出山茶属3种植物茶梅、攸县油茶及多齿红山茶花药花粉经超低温保存半年后仍具较高的活力，甚至超过保存前的水平。已见报道的农作物花粉超低温保存研究还涉及瓜菜、经济作物、药用植物和牧草等几大类物种，包括洋葱、芹菜、橄榄型油菜、番茄等蔬菜作物；杜仲、鹅掌楸等经济林木；魔芋、甘蔗、茶树、诸葛菜、人参、西洋参、枸杞等药用植物；象草、无芒麦草、等牧草[1,3-10]。

5 展望

近年来，随着分子生物学和多学科交叉研究技术的迅速发展，花粉保存技术的研究也在不断深入。科研工作者前期对植物花粉进行了大量研究，特别是在花粉保存方法和技术程序方面取得了很好的效果，但是依然存在一些问题：

（1）植物花粉不同的保存方法的保存机理研究较少。花粉生活力在保存前后的改变与花粉膜透性、细胞内含物质、植物抗氧化酶系统等之间的关系研究还不够深入，花粉保存机理研究相对较少，关于花粉细胞学方面的研究报道较少。

（2）不同保存方法保存花粉后生活力的保障是关键。花粉经过保存后是否保持其原有的生活力是判断花粉保存方法是否有效的主要衡量指标，目前大多数花粉活力通过花粉萌发率来判断，但是能够萌发的花粉有的活力较低，在杂交授粉时不一定能够结实，故花粉萌发率不能真实的反映花粉的生活力。而通过染色法检测花粉生活力的方法快速简单，主要靠人为观察颜色，有时受到花粉颜色的干扰存在一定的误差，也不能很精准的判断出花粉生活力。因此为了更好的研究不同物种花粉的适宜保存方法和效果，花粉生活力的判断不仅要结合离体萌发率测定，也需要结合人工授粉结实率来计算。

（3）超低温保存技术是进行种质资源保存的一条重要途径，也将成为花粉保存和研究的重要方向。目前超低温保存花粉技术已经成功应用于农作物、瓜菜、药用植物、木本科植物等多种植物中，具有较大的应用价值，但是多数集中在花粉适宜含水量、花粉复苏方式等研究上，而关于超低温保存植物花粉的一套标准操作流程尚未建立[29]，且关于花粉保存前后的生理生化研究及保存后遗传稳定性研究也相对较少。

花粉的长期保存具有重大的应用潜力，尤其解决杂交制种过程中花期不遇、花时不同步、制种用工难、机械化程度低、提高制种产量、父本知识产权保护以及濒危植物种质资源保护等方面都发挥着巨大作用。