三代测序技术在临床微生物检验中的应用进展

2023-03-09 21:15武玉晶刘爽田亚琼范志娟张磊刘树业通信作者
医疗装备 2023年2期
关键词:碱基基因组测序

武玉晶,刘爽,田亚琼,范志娟,张磊,刘树业(通信作者)

天津市第三中心医院检验科·天津市重症疾病体外生命支持重点实验室·天津市人工细胞工程技术研究中心·天津市肝胆研究所 (天津 300170)

由于全球环境变化、人类活动和公用卫生系统薄弱等因素,新型感染性疾病越来越常见[1]。感染性疾病是一类由于病原微生物感染而引起的疾病,基于所感染微生物的种属和耐药性选择针对性抗生素是临床治疗的金标准,但传统基于生化或分离培养的微生物鉴定方法因耗时长、假阴性结果较多等缺点给临床诊治造成巨大困扰。分子生物学方法鉴定微生物能在一定程度上缩短周转时间、提高准确率。质谱技术,尤其是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术已经在临床微生物实验室常规应用,但需将细菌分离培养,且鉴定菌种范围也受限于数据库的大小。聚合酶链式反应及其衍生芯片等技术能针对某种微生物的靶基因判断是否出现特定微生物感染,宏基因组测序技术可无偏倚地对标本中的所有微生物核酸序列进行检测,但需排除定植菌污染,且读长短,数据分析难度较高。三代测序(third generation sequencing,TGS)技术无需扩增,可产生较长的读长,是一项鉴定微生物的新兴技术,有望提高临床诊断、研究及追踪感染性疾病的能力。本研究就TGS 技术在病原微生物检验中的作用及特点作一综述。

1 TGS 检测原理

TGS 技术主要包括2种方法:一种是纳米孔技术,其代表是英国牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies,ONT);另一种是单分子荧光测序技术,以美国太平洋生物的单分子实时测序(single molecule real-time,SMRT)技术为代表。TGS 共同点是无需扩增,可直接检测单个DNA 或RNA 分子的碱基,但由于检测原理并不相同,又具有不同的特点。

1.1 纳米孔测序

ONT 公司在2014年首次介绍了MinION 平台,不同于二代测序的边合成边测序方式,该平台测序的核心部件是蛋白质纳米孔。在纳米孔系统中,纳米孔插于可施加电压的膜上,在膜上形成通道,当施加跨膜电压时,就可以通过检测DNA 或RNA 不同碱基核苷酸通过纳米孔时引起的微弱电流变化来鉴别核酸序列[2]。

纳米孔测序具有以下优势。(1)读长长:二代测序的单片段读长一般不超过400 bp,而纳米孔测序无需打断待检核酸片段,读长一般在500 bp 以上,可高达2 Mb[3];实际上,纳米孔测序读长长度的限制并不在于测序技术本身,而在于文库制备中,需提取出完整的待检DNA 或RNA 填充至流动池中[4];超长读长使得纳米孔技术具备很多优势,如无需准备复杂文库就能实现基因组从头组装,确定含有长重复序列的基因组区域,以及研究基因组内的结构变异[5]。(2)数据处理难度降低:相较于二代测序,TGS 结果无需生物信息分析专家,对普通用户更加友好。(3)经济快速:与Illunima 等二代测序设备相比,MinION 平台进行测序所需要的成本更低,约100美金;MinION 测序也无需对核酸进行片段化,最快可在10 min 内完成样本建库;纳米孔测序实时读取的特点意味着在生物样本解释开始之前无固定的最小运行时间,检测时间往往在几小时[6]。(4)纳米孔测序MinION 设备袖珍:纳米孔测序设备不需要成像设备,检测系统体积较小,尤其是MinION Mk1B 设备仅重90 g,大小为3.3 cm×10.5 cm×2.3 cm,能够直接放在手掌中;该设备可通过笔记本电脑的USB 接口供电,在实验室外环境中也可使用,实现了真正的现场检测。

纳米孔测序也存在一些不足,主要是通量较低和错误率较高。根据检测核酸分子类型和建库方法的差异,纳米孔测序的错误率一般在5%~20%间,错误类型主要是插入和删除,通常需要短读长测序方法(如二代测序)进行验证或纠错[7]。

1.2 单分子荧光测序技术

SMRT 是最早被商业化的TGS 技术[8],其核心技术是零级波导技术和荧光集团标记在核苷酸的3’端[9]。前者依靠于一种直径远小于检测激光波长的孔,约为10~50 nm,其底部固定有DNA 聚合酶,激光照射在检测孔底部发生衍射,照亮局部较小的范围,只有在这个范围内,核苷酸携带的荧光基团被激活后才能被检测到,从而避免背景干扰[10]。在DNA 合成过程中,3’端结合荧光基团的化学键断裂并释放荧光基团,检测系统通过荧光基团在检测孔底部停留的时间长短,判断检测到的荧光标记碱基是否与模板链碱基相匹配;以此为基础,SMRT可在合成互补链时,实时记录不同碱基上标记的不同荧光信息来确定碱基序列。

与纳米孔测序类似,SMRT 测序也具有省时快速、无需扩增直接测序、较为简单的数据处理流程和长读长等特点,并在重复区域测序中表现出十分优越的性能。一项多中心研究果显示,相较于短读长检测平台,TGS 技术在高重复区域表现出最佳的序列定位性能[11]。天然DNA 分子可能携带不同类型的碱基修饰,如甲基化,而这些表观遗传修饰可直接被SMRT 设备检测到;而单分子测序数据中的表观遗传信号相对较弱,需在特定位点进行高覆盖率检测才能确定其是否被修饰[12]。因此,SMRT 主要用于绘制较小基因组中的表观遗传信号,如结核杆菌菌株中的甲基化模式[13]。与纳米孔测序的系统错误不同,SMRT 测序错误是随机错误,测序错误率约为15%,碱基错测率约为1%,可通过提高测序深度降低错误率[14]。

2 TGS 临床应用现状

TGS 结合16S rRNA 或全序列测序技术可针对标本中的所有微生物进行无偏向性测序,可鉴定已知或未知的病原体,对细菌中的耐药基因也有良好的检测效果;同时,ONT 的MinION 设备袖珍,可用于实验室外环境中进行检测,为将来的快速床旁测序提供可能性。

2.1 微生物鉴定中的应用

与传统微生物鉴定方法相比,TGS 技术不必依赖于分离培养和生化反应,可直接对微生物进行测序分析,更适合临床少见的疑难菌和难培养菌鉴定。胎儿弯曲杆菌很少引起人类细菌性脑膜炎,但一项病例报道显示,通过纳米孔技术在免疫抑制患者中鉴定出胎儿弯曲杆菌,并将感染病原体鉴定至亚种水平[15],为临床治疗提供了决策性指导。Sanderson 等[16]通过Illumina 测序平台和ONT 同时对9个超声处理液样本(7个培养阳性和2个培养阴性)进行测序,两种方法检测的结果一致;此外,与分离培养的方法相比,有2个阳性样本被ONT 发现两种额外的微生物阳性,提示ONT 测序具有更高的检测灵敏度。

TGS 读长较长的特点使得其在具有重复序列和复杂结构的基因组研究中更具有优势。有研究者利用TGS 技术的重组装策略,先通过准确率较低的长重叠群构建基因组框架,再利用准确率较高的短重叠群对框架进行纠正,最终获得人巨细胞病毒的碱基序列,准确率高达98.8%[17]。TGS 和宏基因组技术相结合,可快速鉴定标本中的几乎所有病原体,Charalampous 等[18]采用TGS 对患者下呼吸道标本宏基因组检测鉴定病原体及耐药性,检测灵敏度为96.6%,能够准确诊断出混合感染,为临床治疗提供重要依据。

由于TGS 可直接实现RNA 测序,使RNA 病毒检测更加便捷。以往几乎所有RNA 分子测序都需要进行逆转录或扩增[19],但ONT 技术能够在RNA 自然状态下进行测序。2015年首次使用纳米孔技术对RNA 病毒进行直接测序,耗时4 h 产生可靠的基因草图[20],RNA 直接测序有助于揭示表观遗传RNA 修饰和微生物多种性状的变化机制。

2.2 在耐药性检测中的应用

微生物耐药性检测在临床用药方面具有重要的指导意义。微生物基因组的重复序列和质粒中通常包含有重要的耐药性遗传信息[21]。纳米孔测序技术对患者样本进行测序后,将结果序列与已知微生物耐药基因数据库中的参考序列进行比对,可进行实时诊断[22]。TGS技术在检测耐药基因方面具有巨大潜力,碱基可信度也从最初的72%提升至99%[23-24],随着测序深度的加大,有望进一步提高可信度。2019年ONT 发布了一款新的芯片R10,具有Q50级别的通用序列可信度,即碱基结果的可信度为99.999%,每100 000个碱基中出错的碱基数为1。研究证明,基于基因组学的抗菌药物敏感性预测与通过稀释进行的最小抑菌浓度试验结果的一致性高达98%[25]。SMRT 技术被报道用于鉴定耐多药鲍曼不动杆菌耐药原理,发现其属于一种新的序列类型和克隆复合体,并含有几个耐药基因,有力地解释了耐多药鲍曼不动杆菌的某些耐药表型发生的分子机制,并为临床抗菌药物的选择指明了方向[26]。Tada 等[27]使用SMRT 技术对住院患者中分离出的耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌菌株NCGM1984进行完整的基因组测序,发现该菌株含有位于染色体不同位点的两个IMP-34型金属β-内酰胺酶,基因组中含有6组多于10 000 bp 的相同碱基对,证实为古噬菌体。此类基因区域的重建很难通过短读长的二代测序技术实现,TGS 技术有助于通过基因转移阐明细菌耐药基因的进化过程[28]。在病毒基因检测方面,TGS 技术通过长重复基因序列检测的优势证明了甲型流感病毒缺陷型干扰颗粒存在于人类甲型流感病毒感染中,这一研究结果为理解甲流病毒复制和发病机制提供重要的线索[29]。

相较于传统药敏鉴定方法,TGS 技术在缩短检验周转时间方面具备巨大优势。Leggett 等[30]表明,纳米孔技术结合优化工作流程可将婴儿粪便样本细菌鉴定和药敏结果检测的周转时间缩短到5 h 以内;同时,TGS 基因型检测与表型的相符度较高,可达98%。与二代测序相比,TGS 技术读长长,在检出耐药基因重复序列和可移动遗传元件方面更有优势,是颇具应用前景的耐药基因检测平台。

2.3 在传染性疾病中的应用

ONT 的测序设备MinION 相较于NGS 平台设备,除了体积更小(仅U 盘大小)、成本更低[31-32]以外,还可对多种标本类型进行实时的现场分析[33]。在西非埃博拉病毒流行期间,MinION 能够实现院外床旁检测病毒,并在1 h 内完成测序工作,在接收埃博拉病毒阳性样本后的24 h 内即可给出诊断结果,有助于对疫情的实时监控[34]。在医疗资源有限、病毒随时变异的情况下,纳米孔测序技术能较大程度上帮助鉴定病原体。在2019年河北省某市的腺病毒疫情中,工作者应用纳米孔测序技术分别在14 min 和22 min 检测到混合样本和单样本的7型腺病毒序列,3 h 内产生的测序数据基本覆盖腺病毒的参考基因组[35]。TGS 技术快速检测病毒及其基因组序列为感染原确定和疫情溯源提供了重要参考。TGS 在极端环境下的稳定性也已有文献报道,研究者利用纳米孔测序进行宏基因组测序检测加拿大高纬度永久冻土中微生物群落,检测结果与二代测序结果一致[36];TGS 技术还可用于在国际空间站中检测λ 噬菌体、大肠杆菌和小家鼠的基因组,证明了该技术在国际空间站中进行测序分析和微生物鉴定的可行性[37]。值得注意的是,这些研究中应用的检测标本并非是人体标本,TGS 在极端环境中进行人类感染性疾病的病原体鉴定及其性能还需进一步验证。

在最近的新型冠状病毒疫情防控中,一项纳入1 200名受试者,共采集23 427个样本(3 966个拭子,19 461个唾液标本)的多中心前瞻性研究[38]中,纳米孔测序结合环介导等温扩增技术诊断的灵敏度和特异度均大于99.5%,是一种高度准确的检测方法,也是RT-qPCR 的潜在替代方法。有研究通过纳米孔结合环等温扩增方法成功检出便标本中低浓度的新型冠状病毒,使用ONT 平台检测新型冠状病毒核酸的检测下限较低,可检出10 copies/mL 载量的病毒[39-40]。ONT 平台最新VolTRAX 实现了样本提取、自动上样、智能化测序和数据分析的一站式服务,能够给出病原微生物及其耐药性基因的分析鉴定结果。

3 限制及展望

由于微生物基因组中扩增子序列的高度相似性,二代测序的读长较短、数据分析难度较大限制了其在微生物鉴定的应用,而TGS 读长更长,可鉴定至种或更低水平,有助于准确、高效地检测临床样本中的多种微生物。但TGS 技术也存在一些不足,纳米孔测序和SMRT 技术都不能反复对一段序列进行测序,导致测序深度不够,结果数据准确性和通量都较低;随着平台技术改进和信息分析算法的优化,TGS 技术的准确率已经由早期的80%左右提高至约95%,但电场力驱动核酸通过孔径速度过快与电流信号叠加等因素仍是提高准确率的最大阻碍[41],也是限制TGS 技术进一步向临床推广的重要因素。希望随着医学微生物学、工程技术、生物信息分析学以及交叉学科的不断创新发展,TGS技术能够得到进一步完善。

总之,传统病原体培养鉴定耗时长、阳性率低等不足影响临床患者诊治,二代测序技术建库耗时长、数据信息处理难度较大、成本高等缺点也限制其在微生物检测中耐药性判断方面的应用范围,TGS 技术在周转时间、成本、数据处理、测序读长和仪器便携性等方面具有诸多优势,弥补二代测序和传统病原学诊断方法的不足[42]。面对临床快速鉴定感染病原体物种和耐药特征的需求,TGS 技术有望成为病原微生物鉴定的主要发展方向。

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