抗β2 糖蛋白1 抗体检测结果差异化的研究进展

2023-03-09 21:15谢茜赵铁锁通信作者丁亚辉李忠信王文强
医疗装备 2023年2期
关键词:构象表位磷脂

谢茜,赵铁锁(通信作者),丁亚辉,李忠信,王文强

1 新乡医学院 (河南 新乡 453003);2 郑州安图生物工程股份有限公司 (河南 郑州450016)

抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)是一种以反复动静脉血栓形成、病态妊娠(通常表现为多次不明原因流产或死胎)、血小板减少等为主要临床表现的自身免疫性疾病。APS 的临床表征可累及心脏、肺部、肾脏以及中枢神经系统等全身各个器官,属于非器官特异的自身免疫性疾病,同时还伴有抗磷脂抗体(antiphospholipid-antibody,aPL)持续阳性[1]。抗β2糖蛋白1抗体(anti-beta2 glycoprotein 1,anti-β2-GP1)作为APS 分类的重要指标之一,自2006年的札幌会议后,其在APS 诊断中的作用逐渐被临床重视起来[2]。随着对APS 的研究越来越深入,临床对anti-β2-GP1检测方法、检测样本的采集、抗原的使用、质控品、标准曲线的建立、参考值的建立、结果的分析等提出了要求和建议[3]。本研究就anti-β2-GP1的检测现状进行综述,并对检测结果差异化的原因进行分析。

1 β2 糖蛋白1 作为aPL 靶抗原的发现

1986年Harris 等[4]统计了30个实验室反馈的检测抗心磷脂抗体(anti-cardiolipin,aCL)的室间质评结果后得出结论,所有的无效检测方法均单独使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)并添加牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)及明胶作为血清样品及标记抗体的稀释液;有效检测方法则使用血清/血浆作为稀释液;此外,不同来源的抗原对检测结果并无显著影响。另有一项研究发现,只有使用血清/血浆作为稀释液才能使心磷脂(cardiolipin,cL)与aCL 结合,因此推测血清/血浆中含有一种辅助因子,并于1990年通过离子交换色谱分析法将该辅助因子分离纯化[5]。研究证实,该辅助因子为β2糖蛋白1(beta2 glycoprotein 1,β2-GP1)[6],此后β2-GP1作为aCL 的一种靶抗原开始被熟知。

2 β2-GP1 简介

β2-GP1又被称为载脂蛋白H(apolipoprotein H,APOH),在人类中由APOH 基因编码,定位于染色体17q23-24。它是一种由肝细胞合成的糖蛋白,分子量为50 kD 左右,在血液循环中以游离形式存在,血浆含量约为150~300 μg/ml,进化高度保守,几乎存在于所有哺乳动物中,且同源性高达74%~83%(人、犬、小鼠、大鼠、牛)。β2-GP1是由326个氨基酸残基组成的单一多肽链,以脯氨酸(Pro)的含量最高,其次为半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)。其结构可分为5个结构域(Domain Ⅰ~Ⅴ),每个结构域为短的重复序列片段(short consensus repeat,SCR),符合补体调节蛋白(complement control protein,CCP)的结构模型,为保守的CCP 序列,由Cys-Pro 残基进行连接,其Cys 残基在Cys1-3和Cys2-4之间形成二硫键。Domain V 额外含有一个二硫键和C 端残基,其带正电荷氨基酸序列(Lys282-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287)为与阴离子磷脂进行结合的主要位点[7-12]。

3 β2-GP1 构象变化的研究进展

1994—1996年期间的多项研究发现,使用表面被强辐照过的96孔聚苯乙烯透明微孔板(ELISA微孔板),可使aCL 在没有cL 存在的情况下识别β2-GP1,并认为cL 或者辐照过的微孔板可使β2-GP1的结构发生改变[13-15]。相关共识也指出,推荐使用负电荷(高结合力或经γ 射线照射后)微孔板检 测anti-β2-GP1[3]。1998年,Koike 等[16]基 于 人类H 因子的结构,通过核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)建立了β2-GP1的同源模型,即由5个圆柱体的结构域构成的环状结构。1999年,Schwarzenbacher 等[17]由晶体结构的分辨率推导出了β2-GP1的鱼钩状构象。2002年,Hammel 等[18]通过小角X 线散射法(small-angle X-ray scattering,SAXS)提出了β2-GP1为S 型结构,且在Domain Ⅰ上存在碳水化合物侧链,可能覆盖表位甘氨酸40-精氨酸43(G40-R43)。2006年,De Laat 等[19]发现,将碳水化合物移除可提高β2-GP1与anti-β2-GP1的亲合力,进一步证实了Hammel 等[18]的理论。该研究同时发现anti-β2-GP1可分为两类:一类与血栓相关,在β2-GP1变构的情况下可识别Domain Ⅰ的G40-R43表位;另一类与血栓相关性不大,可结合β2-GP1的其他结构域,且不受构像的影响。

2010年,Agar等[20]使用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)将β2-GP1放 大 了20万 倍,通过肉眼观察到了β2-GP1的构象,并发现通过调节pH 及盐浓度可以使β2-GP1的构象发生改变,该变构为可逆过程。在正常人血浆中纯化出来的β2-GP1为闭环状态,在高盐高pH(1.15 M NaCl,pH=11.5)的条件下,其由闭环状态变为鱼钩状构象;在低盐低pH(150 mM NaCl,pH=3.4)条件下,其由鱼钩状重新变回环状构象[21]。Agar 等[20]还同时验证了,APS 患者体内的抗体不能直接与环状β2-GP1结合,但重组鼠单克隆抗Domain Ⅳ抗体可直接与环状β2-GP1结合。

综上所述,在生理状态下,β2-GP1的Domain Ⅰ和Domain Ⅴ结合,呈闭环状态;在病理状态下,β2-GP1带正电荷的Domain Ⅴ与cL 等带负电荷的磷脂结合,呈打开状态可识别aPL。在体外,高盐高pH 条件下β2-GP1也可从闭环状态到打开状态,呈现鱼钩状,可与aPL 进行结合;在低盐低pH 条件下可重新恢复至闭环状态,此时无法识别aPL。

4 anti-β2-GP1 检测的研究进展

大量研究表明,anti-β2-GP1 具有很强的异质性,针对各个结构域均有相应的抗体,且分为IgG、IgM、IgA 等不同亚型[22]。目前,APS 的分类标准和国际共识仅将anti-β2-GP1 的IgG 和IgM 亚型被列入标准抗体检测范围[2-3]。但相关标准和共识并未对各个亚型的临床意义得出一致性的结论。Li 等[23]研究认为,anti-β2-GP1 的IgG 亚型与血栓形成关联性更强,而IgM亚型与不良妊娠相关。Swad źba等[24]的研究认为,在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)继发抗磷脂综合征患者中,anti-β2-GP1 的IgM 亚型与血栓形成没有关联。Danowski 等[25]的研究认为,anti-β2-GP1 在临床诊断SLE 患者静脉和动脉血栓形成的高风险方面具有一定作用,IgG 亚型与静脉血栓形成相关,IgM亚型与动脉血栓形成相关,IgA 亚型与APS 无关。Del Ross 等[26]首次报道了anti-β2-GP1 的IgM 亚型与视网膜血栓形成有一定关联。Lee 等[27]的研究认为,anti-β2-GP1 的IgA 亚型与SLE 患者的动脉血栓形成更加相关。2021 年的一项中心实验室研究认为,anti-β2-GP1 在SLE 患者中以IgA 亚型抗体为主[28]。此外,IgA 亚型anti-β2-GP1 还与中风、静脉血栓形成、血小板减少、网状青斑、癫痫和瓣膜性心脏病等相关[29-31]。这些研究的差异可能与β2-GP1 的抗原表位有关。

目前针对β2-GP1抗原表位的研究是通过重组各个结构域的突变体来进行的。多数研究人员认为,针对Domain Ⅰ的抗体的IgG 亚型与血栓形成更加相关,针对其他结构域的抗体与血栓形成不相关[19,32-33],但也有研究认为,针对Domain Ⅳ的抗体也与血栓形成相关[34]。后续Iverson 等[35]的研究表明,在Domain Ⅳ上可能存在2个不连续的表位,有些抗体可结合单独的Domain Ⅳ,而有些抗体必须在Domain Ⅴ存在的情况下才能结合Domain Ⅳ,且与动脉粥样硬化综合征相关,同时发现针对Domain Ⅰ的抗体也有IgA 亚型的存在。国内早期研究显示,28例anti-β2-GP1阳性APS 患者中,有27例血清anti-Domain Ⅴ呈阳性,因此认为抗体主要结合位点在Domain Ⅴ上[36]。在特应性皮炎儿童的血清中检测出的anti-β2-GP1的主要表位在Domain Ⅴ上的磷脂结合位点附近(以IgG1亚型为主),因此该类抗体无法结合β2-GP1和cL 复合物[35]。Blank 等[37]制备出不同序列的单克隆anti-β2-GP1,这些抗体可分别识别Domain Ⅱ、Ⅲ以及Ⅳ的相关肽段。Murthy 等[38]的研究显示,198例anti-β2-GP1 IgA亚型阳性的SLE 患者中,单一IgA 亚型阳性有57例。针对Domain Ⅳ/Ⅴ的IgA 亚型在IgA 亚型中的占比为54%,其中77%的患者与APS 的临床表现相关。Serrano等[39]的研究指出,在anti-β2-GP1 IgA 亚型单独阳性的血栓性APS 患者中,抗体似乎优先与β2-GP1的Domain Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的3个位点结合,而非Domain Ⅰ或Ⅳ/Ⅴ。

从上述研究可以发现,虽然多组研究人员进行了长时间的努力,但仍未能将β2-GP1不同抗原表位的抗体与相应的临床表征联系起来。研究人员的结论相互矛盾,无法统一。其中最主要的原因可能是,抗原表位为线性和构象表位共存。从哺乳动物的β2-GP1晶体模型可以发现,5个结构域之间会出现一定的糖基化,而糖基化会遮挡β2-GP1的抗原表位。昆虫来源的β2-GP1的分子量为43 kD,而人体内的β2-GP1分子量为50 kD 左右,这可能是因为糖基化程度不同,进而导致不同研究人员得出相互矛盾的结论[40]。还有研究指出,体外实验使用的抗原片段为线性表位,而这些异质性的抗体对抗原表位的识别也会受到空间构象的影响[39-41],不同的构像会暴露或隐藏一些潜在的抗原表位,也会导致无法得出一致的结论。

总之,β2-GP1共有5个结构域,体外实验证明每个结构域均存在能与相应抗体结合的表位,同时anti-β2-GP1还分为IgG、IgM、IgA 3种抗体亚型,极大地增强了anti-β2-GP1的异质性。此外anti-β2-GP1与β2-GP1的结合还依赖于β2-GP1的构像改变。正常人体内的β2-GP1呈环状结构,其Domain Ⅴ与Domain Ⅰ相连,且各个结构域之间有一定的糖基化,遮挡了抗原表位。病理状态下,Domain Ⅴ插入阴性磷脂表面,结构发生改变,表位暴露,可识别aPL。在体外极端环境下(如高盐高pH 等),β2-GP1也可以发生变构,然而β2-GP1的变构过程具有一定的不确定性。目前通过电子显微镜肉眼可观察到的为环状闭合状态(O 型)和打开状态(J 型),此外还有S 型结构。近期有人提出了和J 型对称的L 型结构,J 型和L 型暴露的表位不同[39]。

5 anti-β2-GP1 的检测差异化原因分析

目前,anti-β2-GP1的检测方法主要包括酶联免疫吸附法(enzyme-linked Immunosorbent assay,ELISA)、磁微粒化学发光法(chemiluminescent immunoassay,CLIA)、荧光酶免疫法(fluorescent immunoassay,FEIA)和多重微珠免疫法等。这些方法的检测原理均为间接法检测抗体,即固相化的β2-GP1抗原结合样本中的anti-β2-GP1再连接标记的动物源抗人IgG/IgM/IgA 抗体(标记二抗)。anti-β2-GP1的检测主要受以下因素影响:抗原的来源、二抗的来源及固相化、标记化相关的方法及条件等。

抗原的来源主要包括种属(如人源、牛源)、制备方法(天然提纯、重组抗原)等。虽然β2-GP1的同源性很强,但显然使用人源抗原检测人体内自身抗体的特异度和灵敏度会更优。Cavazzana 等[42]研究了抗原的纯化方式,使用4种不同来源的人血浆和4种不同纯化方式得到的抗原,尽管纯度不同,但检测结果无显著差异。有研究还对ELISA 实验的5个组分(包被缓冲液、微孔板标记液、封闭缓冲液、稀释缓冲液和酶标二抗)进行了差异化研究,发现中性和碱性包被缓冲液的检测结果之间存在差异[43]。这些结论也证实了pH 会影响β2-GP1的变构,导致结果偏差。不同品牌的微孔板之间、不同稀释缓冲液之间存在差异,这些差异的本质也是在不同环境下导致了β2-GP1的结构差异。此外酶标二抗也存在差异:如抗人IgG 按亚型可分为抗IgG1、IgG2、IgG3、IgG4,按结构可分为抗重链(H),轻链(L)以及抗恒定区(Fc)和可变区(Fab)抗体,IgG、IgM、IgA 均有保守的轻链结构域,抗轻链抗体还会出现交叉反应。因此不同的二抗选择对灵敏度及特异度均会产生影响。想要明确anti-β2-GP1检测的真正临床意义,必须以检测结果的准确性为前提,即特异性地检测到靶物质(正确性),且检测结果可重现(可重复性)。最初检测anti-β2-GP1的方法以ELISA 为主,但其易受人工因素影响,其定量结果在室内和室间的可重复性极差,检测结果的变异度可高达90%[44];而全自动检测方法(如CLIA)可大大提升定量结果的可重复性。在检测正确性方面,不同厂家试剂盒的制备工艺和方法学差异较大,尤其是β2-GP1抗原的处理会影响其空间构象及位点的暴露,进而影响与抗体的结合,造成结果的差异化。因此,检测结果的正确性需要依靠针对β2-GP1各个位点的参考品或标准物质。

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