长垣市副猪嗜血杆菌病分离鉴定、血清分型与耐药性检测

2023-03-13 10:58严洪涛
河南畜牧兽医 2023年1期
关键词:长垣血清型琼脂

严洪涛

(长垣市农业农村局,河南 长垣 453400)

副猪嗜血杆菌(Hps)是引起猪格拉瑟氏病的重要病原。Hps作为猪上呼吸道的早期常见定殖菌,也是影响猪群健康的条件致病菌。在猪免疫力下降、免疫抑制或者外界应激作用下,通常引起病猪全身感染和多发性浆膜炎、肺炎、脑膜炎和关节炎,出现发热、呼吸困难、咳嗽、关节肿胀和部分神经症状。此外,Hps感染猪容易继发或混合感染猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪链球菌等其他致病微生物,临床上共染病例多发。各品种和生长阶段的猪均对Hps具有易感性,2~8周龄的仔猪易感性最强,发病率一般为10%~15%,死亡率可达50%以上[1],给养猪业造成重大经济损失。Hps 血清型较多,有关专家用兔抗血清作免疫扩散试验对不同Hps 菌株的热稳定抗原制剂进行测试,发现存在15个不同的血清型,此外,一些血清型还没有分型。不同血清型菌株之间缺乏交叉保护,存在地区差异,甚至同一地区或猪场其血清型也不尽相同[2]。目前,控制这种疾病的主要方法是接种灭活疫苗,这有许多局限性。例如灭活疫苗并不包含在一个地区传播的所有毒力血清型病毒。长期以来抗生素在防治Hps 中得到广泛应用,起到了积极效果,但是不合理地使用使得Hps 耐药性增强,耐药谱进一步扩大,增加了防治难度。

该试验对从河南长垣市部分养猪场采集疑似感染Hps病死猪的肺脏、脾脏、关节渗出液等组织病料进行Hps常规分离、血清型分型鉴定及PCR检测,并对分离菌株药敏特性试验,为副猪嗜血杆菌流行情况和临床筛选药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

无菌采集长垣市部分猪场疑似Hps病死猪的肺脏、脾脏、淋巴结渗出液等组织病料,共35份。

1.2 主要试剂

胰蛋白大豆琼脂(TSA)培养基,胰蛋白大豆肉汤(TSB)培养基,犊牛血清,烟酰胺嘌呤二核苷酸(NAD),微量生化鉴定试剂管,抗生素药敏纸片,HPs 1~15型标准血清试剂盒。

1.3 主要仪器

无菌操作台,高速台式冷冻离心机,水浴恒温(摇床)振荡器,CO2培养箱,高压蒸气灭菌锅,PCR扩增仪。

1.4 细菌纯化培养及镜检

用无菌接种环挑取少许病料接种于TSA平板培养基,置于5%CO2培养箱,37 ℃培养48 h 后,再挑取疑似Hps典型菌落接种TSA平板,继续进行37 ℃、24 h纯培养。挑取菌落制作涂片,革兰氏染色,显微镜下观察其形态学特征。

1.5 细菌NAD依赖性试验

挑取单菌落分别接种于营养肉汤、普通琼脂、血琼脂平板(含0.1%NAD)、TSA 平板(不含小牛血清和NAD)和TSB 培养基(含小牛血清和NAD),置于5% CO2培养箱,37 ℃培养24~48 h,观察细菌不同培养基上生长情况与菌落特征。

1.6 生化鉴定

挑取纯化培养的单个菌落分别接种含有5%的无菌胎牛血清1 μl 和20% NAD 1 μl 的微量生化鉴定管,置于5%CO2培养箱,37 ℃培养24 h。过氧化氢酶试验:在载玻片上将1滴3%的H2O2溶液和挑取少许的纯培养菌落充分混合均匀,观察是否产生气泡。氧化酶试验:将氧化酶试剂直接滴在备检菌落上,观察结果。

1.7 血清型分型鉴定

参考徐引弟等[3]报道的琼脂扩散试验方法进行血清分型。取纯化培养菌落,以PSB缓冲液稀释,8 000 r/min,离心3 min,弃去上清液,再加入PSB 缓冲液,高压灭菌,8 000 r/min,离心3 min,即得分离菌株的分型抗原,用于琼脂扩散试验Hps血清分型鉴定。

1.8 PCR鉴定

采用水煮法提取分离菌基因组DNA,挑取单个菌落加入装有100 μl 双蒸水的离心管内,混匀,沸水浴10 min后,-20 ℃冰浴10 min,于4 ℃、10 000 r/min离心3 min,取上清液作为DNA 模板备用。根据Hps 16S rRNA 序列设计引物,预期扩增目的基因片段大小822 bp。PCR 扩增反应体系为20 μl:2×Master Mix 10 μl,DNA模板2 μl,上、下游引物各1 μl,补足DEPH 水至20 μl。PCR 反应条件为:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性45 s,61 ℃退火40 s,72 ℃延伸60 s,共30 个循环;最后72 ℃延伸10 min。取10 μl目的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.9 药敏试验

应用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的K-B 琼脂纸片法,检测分离菌株对11 种抗生素的敏感性,按照CLSI标准结果判定,抑菌圈直径>30 mm 为敏感(S)、20~30 mm为中介(I)、<20 mm为耐药(R)。

2 结果

2.1 细菌纯化培养及镜检

分离菌在TSA培养基上长出表面光滑隆起、圆形、湿润、边缘整齐、灰白色的菌落,大小为0.5~2 mm。革兰氏染色为革兰氏阴性短小菌,菌体呈单个的球状、细长杆状、丝链状,形体多样化。

2.2 细菌NAD依赖性试验

分离菌营养肉汤、普通琼脂、TSA平板(不含小牛血清和NAD)培养基上均未见菌落生长,而在TSB培养基(含小牛血清和NAD)血琼脂平板(含0.1%NAD)长成半透明、露珠状菌落,无溶血现象,且在含有NAD的TSB培养基中生长良好,表明分离菌生长需要NAD。

2.3 生化鉴定结果

分离菌氧化酶试验为阴性,过氧化氢酶试验为阳性;H2S、脲酶、靛基质试验为阴性;发酵葡萄糖、蔗糖,产酸不产气;不发酵赖氨酸、甘露醇。有23株分离菌符合Hps生化特征。

2.4 血清分型鉴定

血清分型试验结果发现,在23株Hps分离菌中,有Hps血清1型7株,血清4型11株,血清5型2株,未定型3株。

2.5 PCR鉴定结果

利用特异性引物对分离菌株基因组进行PCR 扩增,得到一条长为822 bp 特异性条带,符合预期扩增目的大小,见下图。综合细菌培养特性、镜检、生化特性以及PCR鉴定结果,可判断分离菌为Hps。

图 分离菌株16S rDNA PCR 检测结果

2.6 药敏试验结果

药敏试验结果表明,23株分离菌对头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟敏感性较强,对其他抗生素均有不同程度耐药性,其中对诺氟沙星、复方新诺明、磺胺嘧啶耐药性最强,耐药率分别为69.57%(16/23)、65.22%(15/23)、69.57%(16/23),见下表。

表 23株分离菌对抗生素敏感性检测结果

3 讨论

该次研究对来自长垣市部分猪场疑似副猪嗜血杆菌病死猪的35 份病料进行细菌分离纯培养、镜检、生化试验以及PCR 鉴定,共得到23 株Hps,通过血清型鉴定,23株Hps血清分属于1、4、5血清型及未定型血清,其中优势血清型为1 型占30.43%(7/23)和4 型占47.83%(11/23)。蔡旭旺等[4]报道,我国猪场Hps 优势流行菌株血清型主要为4、5、12 和13 型。该次血清型的鉴定可为今后Hps疫苗研制、菌株血清型的选择提供参考。研究表明,长垣市Hps 在猪场普遍存在,血清型比较多样化,流行菌株复杂,应引起重视。Hps 具有兼性厌氧和V 因子依赖性生长的特点,其分离培养条件比较特殊。Hps 对营养要求很高,初次分离培养需要供给5%~10%的CO2促进生长,且其生长需要V因子[5]。此外,病料采集尽量来自未使用抗生素治疗的病猪和死亡时间在12 h 以内的病死猪。

不同地区、不同血清型Hps 菌株对同一类抗生素的敏感性有所差异。药敏试验可以检测不同Hps 菌株对抗生素的敏感性,以便了解当地抗生素治疗效果,为临床合理使用抗生素提供参考依据。目前,Hps 疫苗接种和抗生素是防控该病的主要有效措施,但是疫苗菌株与田间流行株存在差异,缺乏交叉保护,有可能导致免疫失败。抗生素长期滥用引起耐药性增强以及细菌耐药机制发生变化,使得抗生素选择压力越来越大。该研究中23 株分离菌对大多数抗生素均有耐药性,仅对头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟敏感性较强。这可能与治疗Hps 病选用抗生素有关,也可能与菌株在适应环境生存中产生新的变异株有关。建议选用敏感性强的抗生素进行防治,且交替使用抗生素,避免耐药菌株发生。

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