黑木耳液体发酵条件优化研究

马银鹏 姜 威 张丕奇 戴肖东 周舒扬 马庆芳 刘佳宁 田 爽 朱加楠 张介驰 王天亮

（1黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨 150010；2黑龙江省科学院，黑龙江哈尔滨 150001）

黑木耳Auricularia heimuer是一种重要的食药用真菌[1]，不仅营养丰富，还含有多糖、黑色素、腺苷等活性成分[2-4]，具有止咳化痰、抗氧化、降血脂、抗辐射等功效[5-6]。据中国食用菌协会统计，黑木耳2021 年总产量712.3 万t，已成为我国第二大栽培食用菌。液体菌种的研究和使用促进黑木耳产业迅速发展。传统的固体菌种存在生产周期长、菌龄不整齐、成本高、污染率高等问题[7]。而液体菌种具有生产周期短、菌龄一致、成本低、发菌快且不易污染等优点，是解决固体菌种不足的有效途径之一[8]。因此，食用菌液体菌种的研究逐渐受到重视。

由于菌种特性、培养条件及其优化方法等因素的差异，不同菌株的液体发酵条件差别较大[9]。范秀芝等[10]从22 个国审黑木耳品种中筛选出一株较优的液体发酵高产菌株。王谦等[11]研究发现黑木耳液体发酵的最佳条件为接种量8%，培养基初始pH 5.0，培养温度28 ℃，摇床转速160 r/min。钱雪晴等[12]优化得到黑木耳液体菌种培养基配方：葡萄糖2.16%，牛肉粉0.48%，马铃薯15%，磷酸二氢钾0.33%，硫酸镁0.1%。因此，不同黑木耳菌株需要分别开展液体发酵条件的优化研究，从而获得特定菌株的最佳液体发酵条件。

笔者以黑木耳1703为试验菌株，以菌丝体生物量为评价指标，采用单因素和正交试验优化液体发酵条件，为黑木耳液体菌种的生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）供试菌株：黑木耳1703菌株，由黑龙江省科学院微生物研究所保藏和提供。

（2）供试培养基：黑木耳菌种活化采用PDA 培养基（土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，琼脂粉18 g/L，pH 自然）。液体菌种培养采用PD 培养基（土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，维生素B10.001 g/L，pH自然）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化

将黑木耳1703菌株转接到PDA固体培养基中，28 ℃恒温避光培养10 d活化菌株。

1.2.2 液体菌种培养

用直径1.0 cm的打孔器取相同菌龄活化菌株，接种（5块菌种）于含有100 mL PD培养基的250 mL三角瓶中，25 ℃、160 r/min培养7 d，用于液体发酵接种。

1.2.3 菌丝体生物量测定

液体发酵结束后过滤收集菌丝体，无菌水冲洗3次，80 ℃烘干至恒重，称量菌丝体干重即为菌丝体生物量。

1.2.4 液体发酵条件单因素筛选试验

1.2.4.1 供试碳源的筛选试验

以PD 培养基为基础培养基，分别加入20 g/L 供试碳源果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖，以碳源零添加为空白对照。接种5%液体菌种于含有100 mL 培养基的250 mL 三角瓶中，置于25 ℃、160 r/min 摇床培养7 d。以1.2.3 方法收集、烘干、称量菌丝体。

1.2.4.2 供试氮源的筛选试验

以PD 培养基为基础培养基，分别加入5 g/L 供试碳源麸皮、（NH4）2SO4、豆粉、蛋白胨、酵母浸粉，以氮源零添加为空白对照，置于25 ℃、160 r/min 摇床培养7 d。菌丝体收集、烘干、称量同1.2.3。

1.2.4.3 接种量的筛选试验

液体菌种接种量分别为3%、5%、8%、10%、13%，置于25 ℃、160 r/min 摇床培养7 d。菌丝体收集、烘干、称量同1.2.3。

1.2.4.4 培养基初始pH的筛选试验

PD培养基的初始pH分别调整为5、6、7、8、9，置于25 ℃、160 r/min 摇床培养7 d。菌丝体收集、烘干、称量同1.2.3。

1.2.4.5 摇床转速的筛选试验

摇床转速分别设置为130 r/min、140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min，置于25 ℃、摇床培养7 d。菌丝体收集、烘干、称量同1.2.3。

1.2.5 正交试验设计

在单因素试验基础上，选取葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、培养基初始pH（C）三个因素，设3 因素3 水平L9（33）正交试验（表1）。以菌丝生物量为评价指标，通过极差分析法分析最佳液体发酵条件。进行三次验证试验，验证正交试验结果的有效性。

表1 正交试验因素和水平

1.3 数据统计分析

所有试验均三次重复，数据以平均值±标准差形式呈现。采用SPSS 17 进行数据统计分析，采用单因素方差分析方法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 供试碳源的筛选结果

由图1可知，当碳源为葡萄糖或可溶性淀粉时，黑木耳（1703）菌丝体生物量最高，分别为0.537 g/100 mL、0.509 g/100 mL。单因素方差分析发现，葡萄糖、可溶性淀粉为碳源时与其他碳源的菌丝体生物量差异显著（P＜0.05）。综合考虑成本的因素，黑木耳液体发酵培养基以葡萄糖为最佳碳源。

图1 碳源试验黑木耳（1703）菌丝体生物量比较

2.1.2 供试氮源的筛选结果

由图2可知，当氮源为蛋白胨时，黑木耳（1703）菌丝体生物量最高，为0.520 g/100 mL。单因素方差分析结果，蛋白胨为氮源时与酵母浸粉、尿素的菌丝体生物量差异显著（P＜0.05）；与硫酸铵、麸皮、对照组的菌丝体生物量差异不显著（P＞0.05）。因此，黑木耳液体培养的最佳氮源为蛋白胨。

图2 氮源试验黑木耳（1703）菌丝体生物量比较

2.1.3 接种量的筛选结果

由图3 可以看出，随着接种量的增加，黑木耳（1703）菌丝体生物量呈先升高后下降的趋势。当接种量为8% 时，菌丝体生物量最高，为0.446 g/100 mL。单因素方差分析结果，接种量为8%与3%的菌丝体生物量差异显著（P＜0.05）；与其他接种量的菌丝体生物量差异不显著（P＞0.05）。因此，液体培养黑木耳菌丝体的最佳接种量为8%。

图3 接种量试验黑木耳（1703）菌丝体生物量比较

2.1.4 培养基初始pH筛选结果

由图4 可以看出，随着培养基初始pH 的上升，黑木耳（1703）菌丝体生物量呈先升高后降低的趋势。当培养基初始pH 为6 时，菌丝体生物量最高，为0.467 g/100 mL。单因素方差分析结果，培养基初始pH为6时与培养基初始pH为8、pH为9的菌丝体生物量差异显著（P＜0.05）；与培养基初始pH 为5、pH 为7 的菌丝体生物量差异不显著（P＞0.05）。因此，黑木耳菌丝体发酵培养的培养基最佳初始pH为6。

图4 培养基初始pH试验黑木耳（1703）菌丝体生物量比较

2.1.5 摇床转速筛选结果

由图5 可知，随着摇床转速的加快，黑木耳（1703）菌丝体生物量呈先升高后下降的趋势。当摇床转速为150 r/min 时，菌丝体生物量最高，为0.462 g/100 mL。因此，黑木耳菌丝体发酵培养摇床最佳转速为150 r/min。

图5 摇床转速试验黑木耳（1703）菌丝体生物量比较

2.2 正交试验结果

正交试验和极差分析结果如表2 所示，根据极差分析结果可知，对黑木耳（1703）菌丝体生物量的影响次序为A＞C＞B，即葡萄糖＞培养基初始pH＞蛋白胨，其中葡萄糖对菌丝体生物量影响最大。各因素的最优组合为A2B2C2，即葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，培养基初始pH为6，菌丝体生物量最高。

表2 正交试验和极差分析结果

正交试验方差分析结果如表3所示，葡萄糖、蛋白胨、培养基初始pH 均对黑木耳（1703）菌丝体生物量影响显著（P＜0.05）。三个因素对菌丝体生物量影响次序为A＞C＞B，即葡萄糖＞培养基初始pH＞蛋白胨。方差分析结果与极差分析结果一致。

表3 正交试验方差分析结果

因此，黑木耳（1703）菌株液体发酵最佳条件为葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，培养基初始pH 为6，接种量8%，摇床转速150 r/min。在此条件下重复三次，菌丝体生物量（干）为（0.542±0.103）g/100 mL，高于正交试验各组的菌丝体生物量，因此，该试验设计方法可靠有效。

3 小结与讨论

研究结果表明，黑木耳1703菌株液体发酵最佳条件为葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，培养基初始pH为6，接种量8%，摇床转速150 r/min。

碳源和氮源是影响液体发酵菌丝体生物量的主要因素。试验结果表明黑木耳（1703）液体发酵培养基最佳碳源为葡萄糖，与肖彩霞[13]的研究结果一致，但是荆瑞勇等[14]研究发现黑木耳液体发酵最佳碳源为果糖。试验结果表明黑木耳液体发酵培养基最佳氮源为蛋白胨，与冯小飞等[15]的研究结果一致，但是于海洋等[16]研究发现黑木耳液体发酵培养基最佳氮源为酵母浸膏，谢意珍等[17]研究结果最佳氮源为麸皮。这可能与选用的黑木耳菌株有关。因此，对不同的黑木耳菌株液体发酵条件进行筛选，以优化获得最佳的碳源、氮源。

结果表明，黑木耳（1703）液体发酵的最佳接种量为8%，培养基初始pH 为6，摇床转速为150 r/min。王晨等[18]研究发现黑木耳再生株Aa66液体培养适宜接种量为8%，与笔者研究结果一致。钱雪婷[19]采用响应面法优化秦巴山区黑木耳菌株耳261 的液体发酵pH 为5.85，与笔者研究培养基初始pH基本一致。

黑木耳液体发酵过程中会产生多种活性物质，如多糖、多肽、酶、核酸、氨基酸、维生素等，因此利用液体发酵技术获得代谢产物并研究其活性具有较好的发展前景[20]。试验所得黑木耳（1703）液体发酵条件仅是摇瓶培养结果，后续还需发酵罐放大试验进一步验证。