厦门市生鲜水产品中创伤弧菌基因分型及耐药性研究

◎陈佳璐

（厦门市食品药品质量检验研究院,厦门 361012）

创伤弧菌（Vibrio vulnificus）属于弧菌科弧菌属，是一种革兰氏阴性、嗜盐、氧化酶阳性、兼性厌氧、有荚膜、不产芽孢、有动力的弧菌[1]。创伤弧菌是引起人兽共患病的病原菌，食用受创伤弧菌污染的海产品或水源，或是创口接触了带菌的海水或海洋动物，都有可能感染上创伤弧菌。受到该菌感染后的临床表现主要有原发性败血症、伤口感染及急性胃肠炎三大症状[2]，败血症和伤口感染都以宿主组织中细菌极快复制和皮肤组织广泛损伤而闻名，即使进行了治疗，败血症的死亡率也可高达75%，伤口感染的死亡率可高达50%。该细菌广泛存在于亚热带海洋环境及海产品中，当海水温度持续2 周以上超过20 ℃时，创伤弧菌会大量繁殖。厦门地处我国东南沿海，属于亚热带地区，当地水产品种类丰富，海水水温适宜创伤弧菌的生长。为了解厦门地区水产品中创伤弧菌的污染情况，本研究依据GB 4789.44-2020 中的检验方法对2021-2022 年厦门地区市售的210 份水产品进行创伤弧菌的检测，结合PCR 及VITEK 对分离株进行毒力基因及耐药性检测，以期为水产品创伤弧菌监测工作的深入开展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品

采集厦门地区农贸市场和超市出售的新鲜水产品，涉及海水鱼、淡水鱼及贝类。

1.2 仪器与试剂

CFX96 Touch 荧光定量PCR 仪，美国Bio-Rad 公司生产；Powerpac 基础电泳仪，美国Bio-Rad 公司生产；Gel Doc XR 凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司生产；VITEK 2 全自动细菌鉴定仪，法国生物梅里埃公司生产；Centrifuge 5424 微量离心机，德国eppendorf 公司生产。

细菌分离用培养基购于青岛海博生物技术有限公司、北京陆桥技术有限公司及上海欣中生物工程有限公司，琼脂糖、Taq PCR 预混液、5×TBE、Gelred 染料购于生物工程（上海）股份有限公司，DNA 分子量标准Marker 购于北京索莱宝科技有限公司，革兰氏阴性菌鉴定卡及药敏鉴定卡购于法国梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

现场采集完整个体，置4 ℃保存，4 h 内送实验室检测。

1.3.2 创伤弧菌分离培养

鱼类取其鳃、内脏等易富集微生物的部位，贝类去壳取可食整体部分，共计25 g，剪碎后加入225 mL PNCC 增菌液，36 ℃增菌18 h，转种纤维二糖-多黏菌素E（CC）琼脂平板及改良纤维二糖-多黏菌素B-多黏菌素E（mCPC）琼脂平板，36 ℃培养18 h，挑取可疑菌落，接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆（TSA）琼脂平板，36 ℃纯培养18 h。

1.3.3 生化实验

经革兰氏染色、氧化酶试验、三糖铁实验及嗜盐性试验后，再采用梅里埃生物公司革兰氏阴性鉴定卡鉴定。

1.3.4 药敏实验

取一个或多个纯培养菌落，制成菌悬液，将菌悬液和药敏卡放入VITEK 鉴定仪自动判读数据并给予结果，共检测25 种抗生素。

1.3.5 基因分型

依据GB 4789.44-2020 中的方法对创伤弧菌进行毒力相关基因（vcgC/E）、16S rRNA 基因分型（16S rRNA A/B）、生物Ⅱ型（Bt2）和血清E 型（SerE）检测。

1.3.6 AmpC 酶的检测

提取创伤弧菌的粗酶，通过三维实验进行确证[3]，若看到狭缝与抑菌环交界处的抑菌环变形，细菌扩大生长，可判断结果为阳性。若抑菌环呈圆形，没有细菌扩大生长现象则结果为阴性。

2 结果与分析

2.1 创伤弧菌的污染情况

在210 份水产品中，有69 份检出创伤弧菌，检出率32.85%。其中，贝类检出率达43.33%，其次为海水鱼26.03%及淡水鱼23.40%。见表1。

表1 各类水产品中创伤弧菌的检出率表

2.2 创伤弧菌核酸检测与基因分型

对69 株创伤弧菌进行PCR 检测，结果显示所有菌株均为溶血素A 基因（vvhA）核酸阳性，未检出血清E 型；检出6 株Bt2 核酸阳性，为生物Ⅱ型；vcgC/E 和16SrRNA A/B 分型结果显示有4 种基因型，分别为vcgC 和16SrRNA B（CB 型）53 株，vcgC、16SrRNA A 和B（CAB 型）8 株，vcgE 和16SrRNA（EA型）7 株，vcgC 和16SrRNA A（CA 型）1 株，具体结果见表2。

表2 各类生鲜水产品中创伤弧菌的基因分型表

2.3 创伤弧菌体外药物敏感性

22 种抗菌素药物包括β-内酰胺酶抑制剂、青霉素类、单环素类、头孢类、头霉素类、氨基糖苷类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类等共8 类药物。69 株创伤弧菌的药敏实验结果显示，仅有8 种抗菌素药物100%敏感，其他14 种抗菌素药物均出现不同程度的耐药性，其中，68 株创伤弧菌均对头孢西丁耐药，耐药率98.55%，见表3。69 株创伤弧菌中有12 株菌对2 种以上药物耐药，其样品来源及基因型别见表4。

表3 创伤弧菌药敏实验结果表

表4 耐药菌株的样品来源及基因型别表

3 结论与讨论

由于创伤弧菌的嗜盐性使其广泛存在于海水及水产品中，与霍乱弧菌和副溶血性弧菌同属致病性弧菌，是水产养殖中危害较大的一类致病菌。Yano等[4]研究显示，我国零售海产品创伤弧菌污染率为33%。曹敏华等[5]研究显示，珠海地区海产品创伤弧菌的污染率为43.82%。本次研究结果显示，厦门地区水产品创伤弧菌的污染率为32.85%，其中贝类产品污染最为严重，检出率高达43.33%。造成贝类污染率较高的原因可能与其是滤食性生物有关，这种进食方式使创伤弧菌易被浓缩在肠道和其他组织中。同时，近年来在部分内陆地区的淡水产品中均发现不同程度的致病性弧菌污染[6-8]。本研究发现厦门地区淡水产品也存在创伤弧菌的感染，淡水鱼中创伤弧菌的检出率为23.40%，说明在销售环节采样的淡水产品受到创伤弧菌的污染。采样过程中发现同一商铺同时售卖海水产品和淡水产品，水体可能存在交叉污染，从而造成淡水产品也携带创伤弧菌。

vcgC/E 和16SrRNA A/B 分型结果表明，厦门市售水产品中创伤弧菌基因型呈多样性分布，分别有CB 型、CAB 型、EA 型及CA 型。其中以CB 型为主，存在于所有本次调查的3 大类水产品中，占所测菌株的76.81%，CB 型也是临床分离创伤弧菌的主要基因型[9]。其次为CAB 型及EA 型，占比分别为11.59%及10.14%，贝类产品未检出EA 型及CA 型，CA 型只从淡水鱼中检出一株，其他水产品中均未检出。相关流行病学资料显示[10]，不同基因型可能具有不同的致病潜能，CB 型被认为是一种在临床上潜在的致病基因型，如生食、半生食水产品或是在产品加工处理过程中，一旦手上有伤口，都有感染创伤弧菌的风险。

本研究药敏实验结果表明，该菌对β-内酰胺酶抑制剂、青霉素类、单环素类、头孢类、头霉素类、氨基糖苷类药物有不同程度的耐药性。69 株样品中，其中，对头霉素类药物的头孢西丁耐药的菌株有68 株（98.55%），对头孢类药物耐药和中度耐药的菌株有38 株（55.07%），主要是分布在第一代头孢（头孢唑啉）、第二代头孢（头孢呋辛、头孢呋辛酯），而对第三代头孢（头孢他啶、头孢曲松）及第四代头孢（头孢吡肟）则表现为100%敏感。对氨基糖苷类药物耐药和中度耐药的菌株有10 株（14.49%），对单环素类药物耐药和中度耐药的菌株有7 株（10.14%），对青霉素类药物耐药和中度耐药的菌株有6 株（8.70%），对β-内酰胺酶抑制剂类药物耐药和中度耐药的菌株有3 株（4.35%）。结果显示，创伤弧菌对第三代和第四代头孢、碳青霉烯类及氟喹诺酮类药物敏感，可作为治疗疑似创伤弧菌感染的优先选择药物。

AmpC 酶是革兰氏阴性菌主要产生的β-内酰胺酶之一，按照分子分类法，属于C 类酶，可以水解头霉素类抗生素。头孢西丁对高产AmpC 酶的细菌常表现为耐药，因此，用三维实验对69 株创伤弧菌进行AmpC 酶检测，虽然69 株创伤弧菌均未检出AmpC 酶，但已有研究表明在副溶血性弧菌中检出AmpC 酶[11]，而质粒介导的AmpC 酶的出现，表明AmpC 酶的耐药基因可以通过质粒在细菌间互相传播，导致耐药菌的广泛传播[12]。

以上讨论结果显示厦门地区市售生鲜水产中创伤弧菌的污染情况不容忽视，有潜在的致病风险，应持续对其加强监测并进行深入研究。