紫檀芪通过线粒体途径调控结直肠癌细胞增殖和凋亡

李扬波 董卫国

结直肠癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织2020年发表的数据，结直肠癌发生率在世界恶性肿瘤排行表中居第3位,而且全球死亡病例数超93万例，仅次于肺癌[1]。中国仍是结直肠癌高发国家，2015年新发病例数和死亡病例数分别为388000和187000例[2]。尽管现代诊疗技术在癌症治疗领域取得了巨大进展，但是结直肠癌容易转移，86%的终末期结直肠癌患者会在确诊5年内死亡[3]。目前，结直肠癌的主要治疗方式是手术和联合放化疗，但是由于化疗药物如5-氟尿嘧啶耐药性问题日益严重，导致治疗效果不尽人意。因此，有必要寻找新型低毒且高效的天然抗癌药物，构建新的化疗方案，避免结直肠癌耐药性问题的进一步恶化。

紫檀芪是最初从紫檀心材中分离出来的植物代谢产物，广泛存在于蓝莓、葡萄等浆果中。紫檀芪是白藜芦醇的天然类似物，但是比白藜芦醇具有更强的亲脂性和更高的细胞摄取潜力[4]。紫檀芪具有广泛的药理作用，如抗炎、降低血糖血脂以及营养神经等作用。既往研究证实，紫檀芪可对乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多种肿瘤发挥治疗作用，但对结直肠癌的抗癌作用机制尚不明确[5～8]。本研究探讨了紫檀芪在结直肠癌细胞增殖和凋亡过程中的作用及其机制。

材料与方法

1.实验材料：人结直肠癌细胞株SW480、HCT116、DLD-1和人结肠上皮细胞NCM460购自中国典型培养物保藏中心；紫檀芪购自美国Selleck公司；胎牛血清、RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司; 青霉素、链霉素、CCK-8试剂盒、Hoechst 33258染色试剂盒、ROS检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司; Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司; Apaf-1、AIF、Bax、Bcl-2、Cyt C、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GAPDH、PCNA、survivin兔单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

2.细胞培养和分组：人结直肠癌细胞株(SW480、HCT116、DLD-1)和人结肠上皮细胞NCM460在质量浓度为100g/L胎牛血清、1%抗生素溶液(青霉素 100U/ml和链霉素100g/ml)的RPMI-1640培养基， 37℃、体积分数为5%的CO2加湿培养箱中培养。选用处于对数生长期的细胞进行实验，分为梯度浓度紫檀芪处理组和阴性对照组，阴性对照组加入同浓度的DMSO。

3.细胞增殖实验：用CCK-8试剂盒检测细胞活力。将细胞(5×103个/孔)接种在96孔培养板中，第2天更换上清液，在含有紫檀芪(0、10、20、40、60、80、120、160μmol/L)的新鲜培养基中培养12、24、48h。每孔加入CCK-8溶液10μl，再孵育2h，用酶标仪测定450nm处的吸光度(A)值。

4.Hoechst 33258荧光染色法： 利用Hoechst 33258染色试剂盒检测细胞凋亡。将处于指数生长期的细胞种植于6孔板，培养24h。用含有紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)的新鲜培养基培养24h，然后固定细胞，用PBS冲洗3次，按照说明书用Hoechst 33258染色液染色。在荧光显微镜下观察和捕捉细胞凋亡的形态学特征。

5.Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞术：利用Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。将处于指数生长期的细胞种植于6孔板，培养24h。用含有紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)的新鲜培养基培养24h，收集每孔细胞，PBS冲洗两遍，离心收集细胞沉淀，按照说明书设置单染组和双染组，单染组只加5μl Annexin V-PE或7-AAD，双染组两者均加，置于室温避光孵育15min，随后用流式细胞仪检测。

6.ROS测定实验：利用ROS检测试剂盒测定细胞内ROS水平。将细胞接种于6孔培养板，培养24h后用不同浓度的紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)再培养24h。细胞在含10μmol/L DCFH-DA的1ml培养基中37℃培养20min，用PBS洗涤3次。然后用荧光显微镜观测。

7.线粒体膜电位测定实验：利用带有JC-1探针的线粒体膜电位检测试剂盒测定细胞线粒体膜电位。将细胞接种于6孔培养板，培养24h后用不同浓度的紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)再培养24h。次日去除上清液，并用JC-1染料处理细胞1h，最后使用流式细胞仪检测和分析细胞。

8.Western blot法检测：经上述紫檀芪处理后，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。蛋白质经10% SDS-PAGE电泳分离后，转膜，含浓度为5%的脱脂牛奶TBST中室温封闭1h，TBST清洗4次，每次5min。随后4℃下一抗孵育过夜，TBST清洗4次后，在室温黑暗条件下二抗孵育1h，再用TBST洗涤4次，最后用Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描。

结 果

1.紫檀芪抑制结直肠癌细胞的增殖：将3株结直肠癌细胞暴露于不同浓度的紫檀芪，CCK-8实验结果显示，紫檀芪能抑制结直肠癌细胞的增殖，且呈剂量和时间依赖性, 而在正常人结肠上皮细胞NCM460中，紫檀芪对其增殖的抑制作用较弱 (图1)。此外，可观察到SW480对紫檀芪最敏感，因此选SW480进行以下的实验。

图1 紫檀芪对细胞增殖的影响A.不同浓度的紫檀芪处理结直肠癌细胞(HCT116、SW480、DLD-1) 24h;B.不同浓度的紫檀芪对NCM460细胞的影响; C.不同浓度的紫檀芪处理 SW480 细胞 12、24和48h

2.紫檀芪促进结直肠癌细胞的凋亡：Hoechst 33258染色用于评估暴露于紫檀芪的结直肠癌细胞的细胞核，正常细胞核呈蓝色荧光，而凋亡细胞核呈明亮的蓝色荧光，伴有碎裂和染色质浓缩。随机选择的视野显示，经紫檀芪处理后，结直肠癌细胞的细胞核凋亡水平增加，且呈剂量依赖性。流式细胞术的结果进一步显示，紫檀芪处理组与对照组比较，结直肠癌细胞凋亡率增加，差异有统计学意义(P<0.05, 图2)。

图2 紫檀芪对结直肠癌细胞凋亡的影响A.Hoechst 33258染色观察凋亡细胞(×100)； B.流式细胞术检测凋亡率。与对照组比较，*P<0.05

3.紫檀芪通过线粒体途径促进结直肠癌细胞凋亡：为了确定紫檀芪是否通过线粒体凋亡途径促进结直肠癌细胞凋亡，评估了ROS水平和线粒体膜电位水平的变化。结果表明，与对照组比较，紫檀芪提高了结直肠癌细胞内ROS水平，降低了线粒体膜电位水平，且呈剂量依赖性(P<0.05, 图3)。Western blot法检测用于评估线粒体凋亡途径相关蛋白的水平。结果显示，与对照组比较，紫檀芪处理结直肠癌细胞24h后，AIF、Apaf-1、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达量增加，Bcl-2、PCNA、survivin表达量减少，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05, 图4)。

图3 紫檀芪对结直肠癌细胞内ROS及线粒体膜电位的影响A.DCFH-DA 探针染色观察胞内ROS水平(×200)；B.流式细胞术检测线粒体膜电位水平

图4 紫檀芪对结直肠癌细胞线粒体途径的影响与0μmol/L比较，*P<0.05

讨 论

抗癌药物主要通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用，而细胞凋亡途径主要有两种：外源性凋亡途径和内源性凋亡途径[9]。内源性细胞凋亡主要通过线粒体途径来实现，是一种进化上高度保守的细胞凋亡形式，对多细胞生物的发育和内环境稳定中起着举足轻重的作用[10]。线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放是维持线粒体动态稳定的核心环节，特殊刺激施加于线粒体可以使MPTP的开闭状态改变，实现线粒体通透性的变化，从而在线粒体途径中发挥着关键作用[11]。ROS主要来源于线粒体，而线粒体又是ROS的靶标之一， MPTP短期且可逆地开放会释放少量ROS，有利于细胞生长；然而，持续且不可逆地打开MPTP会导致ROS的爆炸性释放，从而导致氧化应激反应损伤线粒体膜完整性甚至细胞[12]。ROS的积累会损伤线粒体膜，导致氧化应激损伤线粒体膜， 随后MPTP持续开放，从而使得细胞内具有促进凋亡的蛋白Cyt C和AIF从线粒体释放，在细胞质中不断累积[13,14]。紧接着，Cyt C与半胱氨酸蛋白酶家族因子Apaf-1相互作用，Bcl-2家族蛋白被释放到细胞质中，加速细胞凋亡过程[15]。

传统化疗药物随着耐药性的增加，对癌症的治疗效果有限，且细胞毒性等不良反应影响了患者的生活质量[16]。目前，开发新型低毒、高效的抗结直肠癌药物，探索其作用机制成为研究热点[17]。紫檀芪作为植物产生的天然代谢产物，在多种肿瘤中已证明具有高效的抗癌作用。既往研究发现，紫檀芪诱导肝癌细胞氧化应激，通过线粒体途径抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡[18]。然而，紫檀芪对结直肠癌细胞的抑制作用机制暂不明确，本研究探讨了紫檀芪对结直肠癌细胞的抑制作用机制。

经不同浓度的紫檀芪处理结直肠癌细胞后，结果显示，紫檀芪显著抑制了结直肠癌细胞的增殖，并且抑制作用呈剂量和时间依赖性。此外，DCFH-DA探针染色和流式细胞术结果分别表明了紫檀芪可以提高结直肠癌细胞的ROS水平、降低线粒体膜电位水平。同时，Hoechst 33258染色和Annexin V-PE/7-AAD双染流式结果表明紫檀芪能够显著促进结直肠癌细胞凋亡，提示紫檀芪可能激活氧化应激、通过线粒体途径诱导结直肠癌细胞凋亡。因此，笔者进一步通过Western blot法测定线粒体凋亡途径相关蛋白的表达水平。结果显示，与对照组比较，紫檀芪处理组细胞的Apaf-1、AIF、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的水平显著升高，Bcl-2、PCNA和survivin的水平显著降低。综上所述，紫檀芪可增加结直肠癌细胞内ROS水平、降低线粒体膜电位水平，通过线粒体途径促进结直肠癌细胞的凋亡，并且抑制细胞增殖、迁移和侵袭，提示紫檀芪具有治疗结直肠癌的潜在应用价值。