棉花枯萎病室内苗期抗病性鉴定方法及评价

龙天宇,邓亚辉,祖倩丽,杨 龙,曲延英,陈全家

(新疆农业大学农学院/棉花教育部工程研究中心,乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】高密度栽培、宽膜覆盖、膜下滴灌等新技术的应用,使得棉花单产、品质等得到大幅度提高,但是土传病害枯萎病危害也愈发明显[1],棉花枯萎病(Fusarinmoxysporumf.sp.vasinfectum(Atk)Synder et Hansen)是棉花种植期的一种常见土传性病害,是棉花生产上危害最大的检疫性病害之一[2],其病原菌为尖孢镰刀菌萎蔫专化型,属半知菌亚门镰孢属,菌丝透明,具分隔,在侧生的孢子梗上生出分生孢子[3]。陆地棉枯萎病时有发生[4],选育抗病品种是最经济有效的办法[5,7],研究陆地棉种质资源对枯萎病尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusariumoxysporumf.sp.Momordicae)7号生理小种的抗病性。选育和推广抗病品种(系)是解决病害的重要手段,对棉花抗病育种研究有重要意义。【前人研究进展】赵俊兴等[6]对160个陆地棉棉花品种(系)的抗枯萎病鉴定结果分析,枯萎病呈高抗的品种有71个,占测试品种的38.1%。林玲等[7]研究表明,将2014～2017年4 a内共有78样次的棉花品种参加长江流域棉花新品种区试的枯萎病抗性鉴定,高抗和抗性品种比例之和分别为47.6%、55.6%、38.9%、57.1%;参加了江苏省棉花品种区试的抗枯萎病性鉴定的棉花品种共有53样次,参试棉花品种整体对枯萎病的抗性水平较好,高抗和抗性品种的比例之和分别为32.0%、66.7%、62.5%和57.1%。赵沛等[8]研究表明,2010～2019年10年间通过对江西省207份材料进行抗枯萎病性鉴定表明,参试品种的抗枯萎病性水平较高,高抗以及抗病品种占总参试品种的37.20%。【本研究切入点】棉花苗期枯萎病抗性鉴定有耗时短,受外界因素影响较小的特点。需研究确定棉花苗期抗枯萎病鉴定较为准确的方法,并通过区分病级后以品种(系)整体的相对病情指数来评价抗性类型。【拟解决的关键问题】选取265份陆地棉种质资源进行苗期枯萎病抗病性鉴定及评价,筛选出具有抗病性的品种(系),为棉花抗病育种的选育及品种(系)改良提供技术支持和基础材料。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 棉花品种

选取265份陆地棉种质资源材料作为供试品种,材料来源:中国、巴基斯坦、澳大利亚、美国和法国等32个国内外不同地域的陆地棉品种(系),选择中国新疆材料军棉1号为感病对照品种,供试材料均由新疆农业大学农业技术重点实验室提供。

1.1.2 供试菌种

棉花枯萎病病原菌(尖孢镰刀菌7号生理小种)由新疆农业大学农业技术重点实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 棉花枯萎病孢子悬浮液制备

将实验室前期已纯化保存好的尖孢镰刀菌7号生理小种在PDA(马铃薯、葡萄糖、琼脂)培养基上活化,25℃培养箱中暗培养7 d,用无菌镊子挑取直径约为0.6～0.8 cm菌块,取6块移入装有250 mL Czapek's(蔗糖7.5 g、NaNO30.75 g、K2HPO40.25 g、KCl 0.125 g、MgSO4·7H2O 0.125 g、FeSO40.002 5 g、蒸馏水250 mL)培养基500 mL规格的锥形瓶中,置于温度28℃、转速200 r/min全自动控温摇床振荡培养4 d,随后将孢子悬浮液用4层无菌纱布过滤菌丝和菌块,用16×25 血球计数板计数,配制成1×106个孢子/mL浓度的孢子悬浮液,供接种试验备用[9,10]。

1.2.2 棉花种子处理及鉴定苗培育

选取已用硫酸脱绒过的籽粒饱满、大小一致的棉花种子,用70%酒精消毒5 min,再经15%的H2O2表面灭菌3 h,用无菌水冲洗5～6次后播种在无纺布育苗袋的无菌营养土中[11],每个育苗袋种6～7粒种子。以无菌水作对照,设2个重复作接菌处理,每个重复种2个育苗袋,待出土后每个育苗袋只留5株长势均匀的棉苗继续培育,即每个品种(系)留苗15株,每一批种植的品种(系)均以军棉1号作对照品种。培育条件为白天25～30℃,夜间20～25℃,光照时间12 h/12 h,其他条件正常处理,培育幼苗健壮生长。

1.2.3 室内棉花苗期枯萎病种植及鉴定

待无纺布育苗袋培育的棉花幼苗长至两叶一心(两片子叶一片真叶)期时,采用伤根灌菌液的鉴定方法[12],即在无纺布育苗袋中的幼苗周围距离茎约1.5～2.0 cm处采用无菌刀片垂直伤根,接菌前2 d暂不浇水,每个育苗袋用25 mL规格玻璃试管量取20 mL配制好浓度(1×106个孢子/mL)的菌悬液浇灌幼苗根部。接菌后第7 d开始调查棉花枯萎病发病情况,棉苗发病后记录感病对照品种军棉1号的病情指数,待感病材料的病情指数为40.0～66.7时,调查记录各品种(系)的发病情况。图1

注:A、B、C为同一品种(系),A为正常对照,B、C为接种棉苗

1.2.4 棉花苗期枯萎病抗病性鉴定指标及评价标准

1.2.4.1 病害的调查及病级标准

当调查的棉苗普遍发病后,感病对照军棉1号病情指数达到40.0～66.7时,采用5级分级法[7,13],统一记录各品种(系)的病害等级发生情况,计算发病率和病情指数。观察棉苗叶片病变情况,统计并记录病害数据。表1,图2

表1 室内棉花苗期枯萎病发病分级标准Table 1 Grading standards for fusarium wilt Disease in greenhouse cotton seedlings

图2 棉花苗期枯萎病病级标准表型

1.2.4.2 抗病性评价

以病叶调查时的实际病情指数(Disease index,DI)乘以校正系数K校正,计算出相对病情指数(Relative disease index,RDI)来评价各品种的抗性水平。

采用相对病情指数来划分抗性类型,先用50.0除以感病对照实际病情指数,计算校正系数K值,K值在0.75～1.25(50为规定感病对照品种的标准病指,感病对照病情指数应为40.0～66.7),将参试品种实际病情指数乘以K值(%)。

K=50/DIck.

式中,DI为感病对照实际病指,50为规定感病对照品种的标准病指。

相对病情指数(X)=品种(系)病情指数实测值×校正系数(K)。

品种抗病类型根据校正后相对病情指数(RDI)按全国统一标准划分为 5个级别[13]。 表2

表2 室内棉花苗期枯萎病抗病性评价标准Table 2 Evaluation criteria for fusarium wilt Resistance of greenhouse cotton seedlings

1.3 数据处理

利用 Excel 2010及SPSS 19.0软件对调查的数据进行基本计算、处理和相关分析。

2 结果与分析

2.1 重复间发病率与相对病情指数的相关性

研究表明,重复1、重复2的发病率与相对病情指数均呈极显著正相关,其中重复1发病率与重复2相对病情指数的相关性最小,相关系数为0.770;重复1和重复2相对病情指数的相关性最大,相关系数达0.923。表3

2.2 重复间发病率与相对病情指数频率

研究表明,重复1、重复2及均值的分布情况均呈正态分布,重复1发病率的均值为54.91%,标准偏差为19.86%;重复2发病率的均值为53.58%,标准偏差为19.29%;两重复平均发病率的均值为54.25%,标准偏差为18.68%。2次重复的发病率结果相近。图3

表3 两次重复间发病率与相对病情指数相关性Table 3 Correlation between incidence and relative disease index between two repeats

图3 发病率动态分布

重复1、重复2及均值的分布情况均呈偏态分布,重复1相对病情指数的均值为17.43,标准偏差为11.32;重复2相对病情指数的均值为14.82,标准偏差为9.99;两重复平均相对病情指数的均值为16.12,标准偏差为10.45。2次重复的相对病情指数结果相近,相对病情指数范围在10.0～20.0,供试品种(系)的抗性类型整体表现为耐病。图4

图4 相对病情指数动态分布

2.3 不同地域陆地棉材料的抗病性差异

研究表明,相对病情指数最大的是中国云南的材料,其相对病情指数均值为43.3,中国云南的供试材料对棉花枯萎病7号生理小种的抗性较弱;而相对病情指数最小的是哥伦比亚的材料,其相对病情指数为9.3,哥伦比亚的供试材料对棉花枯萎病7号生理小种的抗性较强。表4

2.4 不同来源陆地棉材料的抗病性差异

研究表明,来源为保加利亚、乌干达和中国云南的陆地棉整体抗性表现为感病,澳大利亚、巴基斯坦、中国北京、中国甘肃、中国广西等20个来源的陆地棉整体抗性类型为耐病,中国云南的材料与其他22个不同来源的材料相比具有显著性差异,平均相对病情指数达43.3,其中澳大利亚的平均相对病情指数最小,为11.2,来自澳大利亚的供试材料抗病性高于其他材料。表5

2.5 陆地棉供试材料对棉花枯萎病的抗性反应

研究表明,供试材料对病害的抗性反应主要为耐病和感病类型,无表现免疫(I)的材料。具有高抗(HR)枯萎病特性的材料5份、抗病(R)材料78份、耐病(T)材料材料130份、感病(S)材料52份,占百分比分别为总供试材料的1.9%、29.4%、49.1%和19.6%。图5,表3

图5 供试材料对枯萎病的抗性表现

表4 不同来源材料的抗性差异Table 4 Differences in resistance of materials from different sources

表5 枯萎病下不同来源材料发病变化Table 5 Differences in resistance of materials from different sources

3 讨 论

在抗病品种改良的全过程中,育种亲本的选配、后代群体与新品种(系)抗性表现的评判都依赖抗性鉴定[14,15]。苗期鉴定一直是抗枯萎病鉴定的一个重要组成部分[16]。研究采用强致病力的棉花枯萎病菌7号生理小种进行人工接种,病情发展较高,鉴定效率高。生产上有多数品种(系)的抗病性受环境因素影响具有不稳定性,可通过苗期筛选出来的抗性品种(系)可进行多年、多点联合鉴定,以确保其抗病性的稳定。应用苗期接种病原菌鉴定植株病害抗性,周期短,速度快,可节省人力物力,能快速获得种质的抗性信息[17]。目前,针对不同作物种质资源枯萎病苗期抗性鉴定方面多有报道[18,19],作物苗期抗病性鉴定能短期内反应其抗性,且便于观察和减小外界环境影响。陈振东等[20]用苗期接种法对143份苦瓜高代自交系材料进行枯萎病抗性评价,筛选到具有高抗枯萎病特性的材料1份、抗病材料2份、中抗材料5份。李晓慧等[16]对西瓜枯萎病苗期进行抗性鉴定,通过伤根蘸孢法从40份种质资源中筛选出2份耐病材料。田宇等[21]对50份生菜种质资源进行综合抗病性评价,结果筛选到了10份高抗品种。王禄星等[22]在室内苗期对23份宁夏甜瓜白粉病进行抗病性鉴定,筛选出2份免疫材料、5份高抗材料。

4 结 论

重复1相对病情指数与重复2相对病情指数的相关性最高,鉴定结果稳定。发病率均值大于50%,相对病情指数总体分布大于10小于20,耐病材料最多,鉴定方法可取。中国云南的材料整体抗病性最弱,哥伦比亚的材料整体抗病性最强,其中云南的材料区别于其他来源的材料显著性差异;经抗病性评价,筛选得到了5份高抗品种(系),78份抗病品种(系),130份耐病品种(系)及52份感病品种(系),但无免疫品种(系)。供试品种(系)群体表现出多层次的抗性水平,筛选出具有抗病性的品种(系)携带大量与抗病相关的基因,可应用于抗病基因的挖掘,亦可作为潜在的亲本用于抗病品种改良。