硫红霉素菌渣有机肥对大豆土壤中耐药菌及相关抗性基因的影响

易鸳鸯,谢 芳,田世英,张志东,顾美英,彭小武

(1.新疆环境保护科学研究院,乌鲁木齐 830011;2.新疆环境污染监控与风险预警重点实验室/新疆清洁生产工程技术研究中心/国家环境保护准噶尔荒漠绿洲交错区科学观测研究站,乌鲁木齐 830011;3.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室,乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】抗生素抗性基因作为一种新型环境污染物,其可通过移动基因元件在环境中迁移、转化[1-3]。菌渣废弃物因含有抗生素残留会造成生态环境污染[4]。加大抗生素菌渣的无害化处理,对其后续处置的监测和评估有重要意义。【前人研究进展】抗生素菌渣除含有少量残留的抗生素外,其粗脂肪含量占比为10%～20%,粗蛋白含量占比为30%～40%,可通过水热处理、电子束处理、菌渣热解、厌氧消化、好氧堆肥等技术实现菌渣资源化利用,其中,菌渣肥料化是一种重要的无害化处理途径[5-6]。抗生素菌渣在发酵肥料化过程中,能有效降低其抗生素含量,施用后能有效提高土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量,但对菌渣有机肥施用带来的抗生素抗性基因扩散的生态风险评价不一[7-9]。【本研究切入点】施用硫红雷素菌渣制备的有机肥,大豆土壤真菌丰富度和优势度显著降低,潜在致病菌数量下降[10],但对大豆土壤耐药菌及其抗性基因的影响,尚不清楚。需研究硫红霉素菌渣有机肥对大豆土壤中耐药菌及相关抗性基因的影响。【拟解决的关键问题】以大豆为供试作物,设置药渣有机肥不同施用量处理,分别检测大豆苗期、结果期中的抗生素抗性菌数量和种类,分析不同抗生素抗性基因的丰度变化,为硫红霉素菌渣有机肥施用后对农作物土壤的生物安全性评价提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

以黄豆绥农14号大豆为供试作物,以某生物制药企业硫红霉素菌渣无害化处理后制得的有机肥为施用肥料。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

田间试验地点为新疆某制药企业试验基地,试验共设置3个处理,分别为对照组CK(不施药渣有机肥)、A1(施用硫红霉素菌渣有机肥500 kg/667 m2)、A2(施用硫红霉素菌渣有机肥1 000 kg/667 m2),每个处理为1个试验小区,各小区面积约为1 334 m2。播种前,将菌渣有机肥为底肥施入大豆土壤,取样测定土壤样品硫红霉素残留及理化性质,并按照常规进行田间管理。表1

表1 土壤中硫红霉素残留与土壤理化性质Table 1 Residue thioerythromycin and physical-chemical properties of different treatments soil

1.2.2 样品采集

在大豆出苗期和结果期每个小区选取5个典型样方,每个样方按照“梅花五点”法布设5个分点,采集表层(0～20 cm)土壤,剔除杂质后,将土样充分混匀后用四分法保留2 kg,采集的土样放入装有冰袋的采样箱运回实验室,在24 h内进行抗生素耐药菌计数,剩余土壤样品-80℃保存,备用。

1.2.3 细菌培养与计数

采用稀释平板涂布计数法进行菌落计数,其中未加抗生素的营养琼脂平板用于总菌数计数使用,分别以50 μg/mL的硫红霉素、青霉素、头孢拉定的抗性营养琼脂平板,进行硫红霉素、青霉素、头孢拉定抗性菌的计数。

取10 g土壤样品,置于100 mL无菌生理盐水中,120 r /min 条件下振荡10 min,静止5 min,取1 mL土壤悬液按10倍系列稀释后,取适宜稀释度土壤悬液100 μL,涂布于对应平板上,作3次平行,置于30℃恒温培养箱中培养48 h。

1.2.4 耐药细菌鉴定

观察不同抗性平板,挑选颜色、形态特异的菌落,于相对应抗性平板上划线纯化,30℃培养箱中恒温培养,定期观察,并连续纯化培养,直至获得单菌落。

采用菌落PCR方法,选用细菌16S rDNA序列通用引物27F和1 492R进行耐药菌16S rDNA序列PCR扩增。PCR产物经天根胶回收试剂盒(TIANgel Midi Purification Kit)切胶纯化后,送至生工生物工程(上海)有限公司测序,测序所得菌株序列到NCBI数据库进行BLAST比对,确定与实验菌株亲缘关系最近的属种。

1.2.5 ARGs筛选与扩增

选取典型耐药基因,2种红霉素类ARGs(ermB、ermF)、1种β-内酰胺类ARGs(blaTEM)、2种磺胺类ARGs(sul1、sul2)进行检测,引物序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。

土壤总DNA提取采用快速提取试剂盒(Fast DNA Spin Kit for Soil),并以此DNA为模板,以ermB、ermF、blaTEM、sul1、sul2为目的基因,参照王佳佳[11]、朱玥晗[12]方法进行PCR扩增,PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,判断引物适用性及土壤有无相关抗性基因。表2

1.2.6 不同ARGs的qPCR标准曲线绘制

选择1.2.5所述抗性基因序列大小正确,且特异性好的PCR条带进行回收纯化,纯化后的PCR产物与pMD19-T载体连接后,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取单菌落接种于含50 μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中,37℃震荡培养12 h后,采用天根质粒小提试剂盒(TIAN Pure Midi Plasmid Kit)提取质粒,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表 2 ARGs引物序列Table 2 Primer sequences of antibiotic resitance genes

对鉴定正确的抗性基因质粒,采用Biotek Epoch微孔板分光光度计(美国)进行浓度以及纯度检测,根据测定浓度值计算基因拷贝数[13]。质粒DNA按10倍梯度稀释作为定量标准品反应模版,参照qPCR试剂盒(Quanti Nova SYBR Green PCR Kit)条件进行扩增,反应体系为:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,Forward Primers 0.25 μL,Reverse Primers 0.25 μL,QN ROX Reference Dye 2 μL,模板1 μL,ddH2O 7.5 μL。反应条件为:94℃预变性4 min,94℃,30 s;54℃,30 s;72℃,30 s;30个循环;72℃终延伸10 min。分析各基因序列在不同浓度PCR扩增的Ct值,并以拷贝数的log值为横坐标,Ct值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.7 土壤ARGs的定量分析

分别以各土壤DNA为模版,开展不同基因的qPCR扩增,反应体系和反应条件同1.2.5。待qPCR扩增结束后,明确各土壤样品qPCR扩增的Ct值,并通过标准曲线计算得到土壤样品中目的基因的绝对含量。

1.3 数据处理

利用Excel软件对常规数据进行整理、汇总,采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析,选用GraphPad Prism 8.0.1进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对土壤细菌数量的影响

研究表明,大豆不同生育期可培养细菌菌落数及抗生素耐药菌菌落数之间存在一定差异,大豆苗期土壤中各类细菌数量大于结果期菌落数。各细菌数在数量上排序为苗期A1>结果期A1,苗期A2>结果期A2。在苗期样品中,施加了硫红霉素菌渣有机肥的土壤细菌总数、硫红霉素抗性菌数显著高于对照组,土壤细菌总数为A2>A1>CK,分别为2.52×107>2.43×107>1.87×107;硫红霉素抗性菌数为A2>A1>CK,分别为5.50×103>4.9×103>4.33×103。而青霉素、头孢拉定抗性菌株数与对照组差异不显著。在结果期样品中,施加了硫红霉素药渣有机肥的土壤中各类菌落总数与对照组差异不显著。表3

在苗期的土壤中,尽管硫红霉素抗性菌总数相较于对照组显著增加A2>A1>CK,但其相对丰度却明显下降A1

2.2 土壤中抗生素耐药菌的种属构成

研究表明,共获得各类菌株51株,其中,硫红霉素耐药菌14株,青霉素耐药菌25株,头孢拉定耐药菌12株。经16S rDNA序列分子鉴定,所得硫红霉素耐药菌株分布于11个菌属,其中,假节杆菌属、芽胞杆菌属、类谷氨酸杆菌属菌种数均为2个,其余菌属菌种数均为1个。25株青霉素耐药菌分布于7个菌属,其中链霉菌属菌种数最多,达到18株,占总菌株数比例高达72.00%。12株头孢拉定耐药菌分布于5个菌属,其中,假单胞菌属菌株数最多,占比达到50.00%,其次为链霉菌属和芽孢杆菌属菌。表4

表 3 不同处理下大豆不同生长期土壤中耐药菌数量Table 3 Drug resistant bacteria in soil at different treatments and growth stages of soybean

图1 出苗期硫红霉素耐药菌数相对丰度

表 4 大豆土壤中筛选获得耐药菌菌属分布Table 4 Genus distribution of drug resistant bacteria isolated from soybean soil

2.3 施用有机肥后作物土壤中ARGs的水平

2.3.1 不同ARGs及16S rDNA标准曲线绘制

研究表明,分别以ermB、ermF、blaTEM、sul1、sul2为目的ARGs基因进行qPCR扩增,各扩增基因的标准曲线线性回归方程相关系数R2均高于0.99,各基因浓度与qPCR的Ct值线性相关性较好。表5

2.3.2 土壤中ARGs绝对丰度分析

研究表明,β-内酰胺类ARGs(blaTEM)拷贝数高于红霉素类ARGs(ermB、ermF)和磺胺类ARGs(sul1、sul2)。大豆苗期土壤中ARGs绝对含量均大于结果期。在苗期样品中,施加了硫红霉素菌渣有机肥的土壤其中红霉素类ARGs(ermB、ermF)和16SrDNA拷贝数均高于对照组,但差异不显著;β-内酰胺类ARGs(blaTEM)和磺胺类ARGs(sul1、sul2)绝对含量与对照组差异也不显著。在结果期样品中,硫红霉素菌渣有机肥处理对土壤各类ARGs绝对含量影响不大,且差异不显著。表6

表 5 抗性基因和16S rDNA标准曲线方程Table 5 Standard curve equation of ARGs and 16S rDNA

2.3.3 施用有机肥后土壤中ARGs的相对丰度

研究表明,在大豆苗期不同处理方式下土壤中ermB、ermF相对丰度存在差异,在大豆出苗期,A1和A2的ermB和ermF平均相对丰度均高于CK对照组,但三者间差异不显著。在大豆结果期不同处理方式下土壤中ermB与ermF平均相对丰度也均高于对照组,但差异不显著。图2

大豆苗期土壤中β-内酰胺类blaTEM相对丰度明显高于sul1和sul2,在不同生育期的样品中,blaTEM、sul1和sul2相对丰度与对照组均表显差异不显著。图3

表6 施用硫红霉素菌渣大豆土壤中ARGs的拷贝数变化Table 6 Copy number of ARGs in soybean soil with thioerythromycin residue

(a)大豆出苗期土壤中ARGs相对丰度 (b)大豆结果期土壤中ARGs相对丰度

(a)大豆苗期土壤中ARGs相对丰度 (b)大豆结果期土壤中ARGs相对丰度

3 讨 论

在有机肥的发酵过程中,菌渣中抗生素及相关代谢物残留物或相关抗性基因的降解和转化不彻底,在施用后可能会增加作物土壤中抗生素耐药菌的数量和ARGs的含量,具有潜在的环境安全风险[14-17]。周睫雅[18]发现头孢菌素菌渣有机肥施用对大豆土壤中的细菌丰度影响较小,且对土壤中抗性基因总相对丰度和主要抗性基因的类型影响较小。平然等[19]研究发现,硫酸新霉素菌渣有机肥施用后土壤中硫酸新霉素抗性基因acc(6′)ib相对丰度增加,但显著低于商品有机肥。肖祖飞[20]研究发现,施用制药污泥肥料会增加非根际土、根际土、根和青菜(苏州青)叶际的ARGs丰度和多样性,并推测污泥肥料施用后的土壤是叶际的ARGs的一个主要来源,施用制药污泥肥料会增加ARGs扩散风险。我国每年产生约200多万吨硫红霉素菌渣[21],但硫红霉素菌渣有机肥堆肥处理或处理后应用对土壤中ARGs污染水平研究未见报道。研究通过分析硫红霉素菌渣无害化处理制得的有机肥施用大豆农田其土壤中常见ARGs的绝对丰度和相对丰度变化,结果表明影响不显著。

研究结果表明,在苗期土壤样品中,施加了硫红霉素菌渣有机肥的土壤细菌总数、硫红霉素抗性菌数显著高于对照组,而青霉素、头孢拉定抗性菌株数与对照组差异不显著;在结果期样品中,施加了硫红霉素药渣有机肥的土壤中各类菌落总数与对照组差异不显著,与Wang等[22]在对青霉素药渣有机肥施用后相关结果一致。

在有机肥如粪肥或者堆肥施用到土壤后,因打破了原有土壤中营养组成会出现微生物菌群快速响应,此时的ARGs的丰度会明显提高,当不再继续施肥时,ARGs的丰度会逐渐减少[23-24]。研究发现,在大豆苗期土壤中红霉素类ARGs(ermB、ermF)、β-内酰胺类ARGs(blaTEM)和磺胺类ARGs(sul1、sul2)的绝对含量均大于结果期,也可能与此过程相关。研究也发现在施加有机肥不同生育期土壤样品中,施加了硫红霉素菌渣有机肥的土壤中红霉素类ARGs(ermB、ermF)平均含量高于对照组,但差异不显著,且β-内酰胺类ARGs(blaTEM)和磺胺类ARGs(sul1、sul2)含量与对照组差异也不明显。施加硫红霉素菌渣有机肥对土壤中常见ARGs的影响不大,但后续影响还有待进一步跟踪开展。

4 结 论

施用不同浓度的硫红霉素菌渣有机肥后,高浓度菌渣有机肥处理土壤中抗性菌数量高于低度浓度菌渣有机肥处理,且苗期抗性菌数量均大于结果期,但随着大豆的生长抗性菌数量均明显下降,并且与CK相比,硫红霉素、青霉素、头孢拉定的数量在大豆苗期、结果期均未明显增加。获得14株硫红霉素耐药菌菌株分布于11个菌属,其中假节杆菌属、芽胞杆菌属、类谷氨酸杆菌属菌株数占总菌株数的比例最高;25株青霉素耐药菌菌株分布于7个菌属,其中链霉菌属菌株数最高;12株头孢拉定耐药菌分布于5个菌属,其中假单胞菌属菌株数最高占总菌株数的比例达到50.00%。施用硫红霉素菌渣有机肥土壤中常见ARGs的绝对丰度和相对丰度有一定的影响,但影响不显著。