红花除虫菊和甘野菊的花粉采集与贮藏

雒新艳，刘 英，王利红，张俊丽，李芳，王 辉，卢 洁

（1.潍坊职业学院，山东潍坊 261000；2.山东省林木种苗和花卉站，济南 250014）

红花除虫菊［Pyrethrum coccineum（Willd.）Worosch.］和甘野菊［Dendranthema lavandulifoliumvar.seticuspe（Maxim.）Shih］是盆栽菊的近缘种质，抗逆性良好，可用于盆菊栽培品种的改良，但两者的自然花期均早于盆菊，若要开展杂交工作，可以选择将野生近缘种质的花粉贮藏或者通过遮光处理把盆菊的花期提前，2 种方法均可实现杂交的目标。研究表明，经过花期调控的植物，因其花期和果期处于不适宜的季节，所产生的花粉通常畸形率高，萌发率大幅下降，受精后的胚在发育中也常会出现败育现象［1］。因此，花期不遇的最佳解决方法是花粉贮藏，但是不同植物花序类型不同，开花进程和持续时间不同，合适的采集时机也不同。不同植物花粉的结构和生理需求不同，适宜的储存条件也不相同［2］。

本研究通过检测不同开花天数和采集时间的花粉萌发率，确定2 个野生菊花种质适宜的花粉采集时机；通过检测不同贮藏条件和时间的花粉萌发率，确定二者花粉合适的贮藏条件与时间，为盆菊野生种质参与远缘杂交奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2 个二倍体野生近缘种质：红花除虫菊（2n=2x=18）和甘野菊（2n=2x=18）。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集 在花序总苞片打开之前，先对花序进行套袋，主要是预防昆虫串粉，与其他花粉交叉混染。红花除虫菊和甘野菊的管状花自外向内逐步开放，从最外层出现花粉到全部筒状花凋萎，大约需要7 d。在此期间，每隔1 d 采集1 次当天的新鲜花粉，经过萌发率检测确定最佳采粉日。之后，在最佳采粉日当天7：00 到17：00，每2 h 取1 次花粉，用毛笔轻轻将花粉刷入硫酸纸袋内，为避免不同单株的花粉差异，将同一种植物不同单株的花粉混合均匀。

1.2.2 花粉贮藏 研究表明，低温和低含水量可以降低花粉细胞的代谢水平和水分子的活动能力［3］，且贮藏时间也是影响花粉活性的重要因素，因此对所有的花粉都进行24 h 的干燥处理，然后对比温度和时间对花粉贮藏效果的影响。设置以下贮藏环境：A，室温硫酸纸袋保存；B，室温离心管密封；C，4 ℃硫酸纸袋保存；D，4 ℃离心管密封；E，-20 ℃硫酸纸袋保存；F，-20 ℃离心管密封，分别对比不同环境内花粉贮藏30、60 d 和90 d 后的萌发率情况。

1.2.3 花粉萌发率测定 离体萌发是检测花粉萌发率有效的方法［4、5］，采用改良ME3培养基+250 g/L PEG 1 500 溶液+150 g/L 蔗糖。ME3培养基［6］的成分为MgSO4·7H2O 370 mg/L、KNO3950 mg/L、KH2PO485 mg/L、CaCl2·2H2O 880 mg/L、NH4NO3412.5 mg/L、KCl 175 mg/L、H3BO350 mg/L、Na2EDTA 7.45 mg/L、FeSO4·7H2O 0.025 mg/L、KI 0.83 mg/L、NaMoO4·2H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、VitB11.0 mg/L、VitB61.0 mg/L。

用胶头滴管吸取加热融化后的培养基，快而稳地滴入双凹载玻片的凹槽内，然后使用毛笔将花粉均匀地播在培养基上，放入培养箱内避光保湿培养4 h（设置温度为25 ℃）。取出载玻片后，在电子显微镜下统计花粉萌发情况，以花粉管长度大于花粉直径作为花粉萌发的标准，每个种质材料随机选择3个头状花序的花粉，每个花序取5 个视野，共15 个视野，统计萌发的花粉数除以总花粉数，计算萌发率。

1.3 数据分析

采用Excel v16.0 软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同花粉出现时间的花粉萌发率检测结果

当红花除虫菊和甘野菊中心的筒状花开始出现花粉时，每隔1 d 采集花粉，其萌发率见图1。由图1可知，在7 d 花粉期内，2 个野生菊花种质的花粉萌发率大体呈先升后降的变化趋势；甘野菊的花粉萌发率略高于红花除虫菊。

图1 不同花粉出现时间对红花除虫菊和甘野菊花粉萌发率的影响

花粉期第一天，2 个野生菊花种质外层管状花的雄蕊花药开裂，出现少量花粉，其萌发率较低；第三天，两者中层大量管状花的花药开裂，产生花粉，其萌发率也迅速升至最高值，甘野菊的最高花粉萌发率为68.2%，红花除虫菊的最高花粉萌发率为65.2%；花粉期第五天，两者的花粉萌发率都开始下降；到第七天，红花除虫菊和甘野菊花粉的萌发率降至最低，分别为25.48%和35.16%。

2.2 不同采集时间的花粉萌发率检测结果

由图2 可知，红花除虫菊和甘野菊花粉萌发率1 d 内的变化情况，两者都是单峰曲线，表明不同时刻的花粉萌发率差异较大。红花除虫菊和甘野菊的花粉萌发率最高值都出现在11：00，分别达到69.2%和72.14%；9：00 时，两者的花粉萌发率均为40%左右；11：00 之后，两者的萌发率都逐渐下降，在13：00时，红花除虫菊的花粉萌发率降至56.40%，降幅大于甘野菊；到15：00 时，两者的花粉萌发率进一步降低，红花除虫菊的花粉萌发率略高于甘野菊；到17：00 时，2 个野生菊花种质的花粉萌发率降到最低，分别为6.79%和12.09%，已不适合用于授粉。

图2 不同采粉时间对红花除虫菊和甘野菊花粉萌发率的影响

2.3 不同贮藏条件下花粉萌发率检测结果

在6 个贮藏处理中分别保存30、60、90 d 后，检测2 个野生菊花种质的花粉萌发率，具体结果见表1。甘野菊新鲜花粉的萌发率（58.94%）高于红花除虫菊（55.78%），所有贮藏方式贮藏后的花粉萌发率普遍低于红花除虫菊，表明甘野菊花粉的贮藏效果不如红花除虫菊。

由表1 可知，2 个野生菊花种质花粉在-20 ℃贮藏条件下效果最好，萌发率均高于室温和4 ℃贮藏的萌发率，30 d 后的萌发率仍超过新鲜花粉的50%，60 d 后的萌发率仍超过新鲜花粉的20%，90 d 后的萌发率依旧高于新鲜花粉的10%，满足授粉的基本需求，可以应用于杂交授粉。其中，离心管密封保存的萌发率略高于硫酸纸袋保存的萌发率，但两者相差不大，这可能是因为在低温条件下，花粉呼吸微弱，氧气的需求较低。

表1 不同贮藏条件下红花除虫菊和甘野菊的花粉萌发率

在室温和4 ℃贮藏条件下，硫酸纸袋保存的效果大部分好于离心管密封，可能是由于花粉呼吸较为旺盛，维持正常生命活动需要氧气的参与。

3 讨论

3.1 花粉采集时机的筛选

通过检测不同花粉期和采集时刻的花粉萌发率发现，当红花除虫菊和甘野菊中心管状花开始出现花粉后的第三天，所采集花粉萌发率最高；1 d 中，11：00所采集花粉的萌发率最高。因此，于晴天11：00时，采自单个花序花粉期第三天的花粉是最理想的授粉材料。实际工作中，为了便于人员和工作安排，花粉采集可在10：00～13：00 进行，所得花粉的萌发率都较高。

3.2 花粉贮藏条件

前人研究表明，低温和低含水量可以降低花粉细胞的代谢水平和水分子的活动能力［7］，且贮藏时间也是影响花粉活性的重要因素。菊科植物的花粉属于三核型花粉，其外壁较薄，对不良条件抵抗力较差，容易失活［8、9］。为解决花期不遇问题，本研究对野生种的花粉贮藏条件进行了分析，发现温度是花粉贮藏的关键因素，-20 ℃是长期保存的最佳贮藏温度，90 d 后花粉的萌发率仍高于10%，基本可以用于杂交；若短期贮藏（1 个月内），可选择4 ℃硫酸纸袋保存或离心管密封，其中，4 ℃硫酸纸袋保存的效果较好。

本试验未使用新鲜花粉作为试验材料，主要是因为含水量高的花粉在室温和4 ℃环境内呼吸和消耗快，容易较快地失去活力；而在-20 ℃环境中，会导致组织结冰，使结构遭到破坏［10］。