绵羊源地衣芽孢杆菌的分离和鉴定

祖丽胡玛尔·艾尼

（塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300）

地衣芽孢杆菌是广泛存在于自然环境中的需氧或兼性厌氧杆状菌，大部分为非致病性菌，菌体杆状两端钝圆或平截，产生芽孢，长度可达10.0 μm。

地衣芽孢杆菌作为对宿主健康有益的天然治疗剂，具有安全、无污染、不含残留化合物等特点［1］，可通过多种机制调节宿主免疫系统，并产生短链脂肪酸提供能量，调节宿主肠道菌群平衡［2］。被广泛应用于医疗、制药、农业和工业及人类保健品等方面［3］。

地衣芽孢杆菌存在大量与碳水化合物代谢有关的基因，以及糖苷水解酶、多糖裂解酶和碳水化合物酯酶等［4］，这些代谢途径中的酶可以帮助部分动物消化。本研究经过细菌分离纯化及形态学观察、生化试验、药敏试验、抑菌试验、16S rRNA 基因序列分析及小白鼠影响试验，为绵羊的生长环境及天然放牧饲养方式研究、提高养殖收入提供理论依据，为绵羊饲料添加剂研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

阿克苏某规模化羊场的一只绵羊胸腔渗出液。

1.2 试验动物

6 只健康昆明小鼠，体重16～22 g，购自塔里木大学。

1.3 试剂与仪器

胰蛋白胨大豆肉汤，购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂粉，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；琼脂糖，购自美国英杰生命技术有限公司；药敏片，购自杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；T5 Zero Vector，购自北京全式金生物技术有限公司；摇床，购自天津欧诺仪器股份有限公司；恒温培养箱，购自上海博讯实业有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）、DL-2000 Marker，购自塔克蓝生物科技有限公司；全能成像凝胶系统，购自诺派森生物科技（上海）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 细菌分离纯化及形态观察 用接种环取胸腔渗出液划线在胰蛋白胨琼脂培养基上，置于37 ℃的恒温培养箱培养14～24 h。挑取单个菌落接种到胰蛋白胨液体培养基上，置于37 ℃、200 r/min 摇菌12～16 h，纯化培养；采集绵羊血制备8%的鲜血培养基，将分离株接种到血平板上，置于37 ℃的恒温培养箱培养22 h 后观察溶血现象。

在无菌操作台里，载玻片上滴1 滴蒸馏水，挑单个菌落涂布均匀，用酒精灯火焰固定后，结晶紫处理2 min、碘液处理3 min、酒精脱色30 s、复红染色液复染30 s，观察细菌形态。

1.4.2 生化试验 将菌液接种于生化管，37 ℃恒温培养14～24 h 后观察结果。

1.4.3 16S rRNA 鉴定 以提取的DNA 为模板，参照参考文献［5］的细菌16S rRNA 基因扩增引物，上游引物序列为27F 5＇ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物序列为1 492R 3＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-5＇，目的条带大小1 500 bp 左右，由上海桑尼公司合成，引物最终使用浓度为10 pmol/μL，稀释后于-20 ℃保存备用。

PCR 扩增体系25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下引物各0.5 μL，DNA 模板2 μL。PCR 扩增程序，94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃终延伸10 min。取5 μL PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。PCR 产物送上海赛恒生物科技有限公司测序。

1.4.4 检测阳性克隆 切胶后按照说明书进行胶回收，目的基因与T5 Zero Vector 连接转化后，将产物在LB 液体培养基置200 r/min，37 ℃摇5 h 后，将菌液涂布到含Amp 的LB 琼脂培养基上过夜培养，挑取单个菌落加入5 μL 无菌水混合均匀作为模板DNA，上下引物用M13F、M13R 扩增PCR。

PCR 扩增体系25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下引物各0.5 μL，DNA 模板2 μL。PCR 扩增程序，94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 个循环；72 ℃终延伸10 min。取5 μL PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。PCR 产物送上海赛恒生物科技有限公司测序。

1.4.5 抑菌试验

1）对金黄色葡萄球菌的抑制。吸100 μL 新鲜的金黄色葡萄球菌菌液涂布至胰蛋白胨琼脂培养基上，用牛津杯打孔后将地衣芽孢杆菌接种至孔里，在37 ℃的恒温培养箱培养14～22 h 后观察结果。

2）对大肠杆菌的抑制。吸100 μL 新鲜的大肠杆菌菌液涂布至胰蛋白胨琼脂培养基上，用牛津杯打孔后将地衣芽孢杆菌接种至孔里，在37 ℃恒温培养箱培养14～22 h 后观察结果。

3）对沙门氏菌的抑制。吸100 μL 新鲜的沙门氏菌菌液涂布至胰蛋白胨琼脂培养基上，用牛津杯打孔后将地衣芽孢杆菌接种至孔里，在37 ℃恒温培养箱培养14～22 h 后观察结果。

抑菌试验结果判定标准如下，抑菌圈直径均≥15 mm 为高度敏感，抑菌效果良好［6］。

1.4.6 药敏试验 取100 μL 的菌液涂布到琼脂培养基上，将药敏片贴到菌液均匀的位置，在37 ℃的恒温培养箱培养14～22 h。测量药敏圈直径（Diameter of inhibition zone，DIZ）。

药敏性结果判定标准如下，DIZ=0 mm 为不敏感；0 mm＜DIZ≤17 mm 为中敏感；DIZ＞17 mm 为敏感［7］。

1.4.7 对小白鼠的影响试验 小白鼠称体重后，分别给试验组小白鼠注射菌液，对照组小白鼠注射等量的生理盐水，其他管理措施不变，21 d 后观察有无不良反应、精神状态、腹泻、中毒等症状，结束后剖解观察内脏有无病理变化［8］。

2 结果与分析

2.1 细菌分离纯化及形态观察

在胰蛋白胨琼脂培养基培养12～16 h结果见图1。由图1 可知，菌落为圆形白色，外观扁平，不透明，边缘不整齐，表面粗糙皱褶。在含8%绵羊鲜血培养基培养22 h 结果见图2。由图2 可知，将菌液接种到鲜血平板上培养后，能观察到草绿色的α 溶血。革兰氏染色镜检结果见图3。由图3 可知，分离株为革兰氏阳性短杆菌。

图2 8%绵羊鲜血培养基的生长结果

图3 革兰氏染色镜检结果（10×100）

2.2 生化试验结果

将分离株接种于生化管培养22 h，结果见表1。由表1 可知，分离株对淀粉水解、触酶、VP、脲酶、甘露醇、硝酸盐还原阳性；对葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、苯丙氨酸、木糖、棉子糖阴性。

表1 生化试验结果

2.3 16S rRNA 基因鉴定结果

选择16S rRNA 通用引物扩增，PCR 产物1%的琼脂糖凝胶电泳结果见图4。由图4 可知，PCR 扩增成功，目的条带大小1 500 bp 左右，符合预期大小。

图4 16S rRNA 扩增结果

2.4 检测阳性克隆结果

从含Amp 的琼脂培养基挑单个菌落进行扩增，结果见图5。由图5 可知，目的片段大小为1 500 bp左右，与预期大小符合。

图5 检测阳性克隆结果

2.5 抑菌试验结果

取分离株100 μL 至对应的孔里，抑菌试验结果见表2。由表2 可知，分离株对金黄色葡萄球菌高度敏感，对沙门氏菌中度敏感，对大肠杆菌低度敏感。

表2 抑菌试验结果

2.6 药敏试验结果

将药敏片贴到培养板上菌液均匀的位置，在37 ℃的恒温培养箱培养22 h，结果见表3。由表3 可知，分离株对阿奇霉素、克林霉素耐药，对四环素、环丙沙星、卡那霉素、呋喃唑啉、庆大霉素、头孢氨苄、万古霉素、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢拉定敏感。

表3 药敏试验结果

2.7 对小白鼠的影响

小白鼠没出现不良反应，精神状态正常，无中毒症状和腹泻，解剖后内脏没有病理变化，分析发现该菌对小白鼠胸腺和脾脏的发育有促进作用，对小白鼠的体质有明显的提高作用。

3 讨论

本研究通过细菌分离纯化及形态学观察、生化鉴定试验、细菌16S rRNA 基因序列分析等方法，确认从绵羊胸腔液分离到的菌株为地衣芽孢杆菌。

地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中应用比较广泛的菌株，国内外对地衣芽孢杆菌应用的报道较多［9-11］，地衣芽孢杆菌作为一种无毒、无残留、无抗药性的益生菌在饲料生产中成为首选的饲料添加剂［12］，在医学上成为增加空肠绒毛高度、改善肠道吸收功能的保护剂［13］，也可以抑制沙门氏菌［14］。在畜牧养殖方面，具有提高水产类的免疫力［15］、提高鸡对沙门氏菌的抵抗力［16］等作用。进一步挖掘新的芽孢杆菌资源，在世界范围内筛选自然环境中的芽孢杆菌，建立地方特色芽孢杆菌资源库，利用地方特色菌服务当地［17］。地衣芽孢杆菌具有菌体繁殖速度快，易培养，抗逆性强，耐酸碱、耐高温、耐胆碱，能分泌蛋白酶以及多种氨基酸等特点，在养殖业有较高的应用价值。

随着抗生素的广泛应用，药物残留和抗生素耐药性呈上升趋势，抑菌试验表明，如出现沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌感染可以将地衣芽孢杆菌当做抑制细菌的替代品。参考文献［13］、［15］、［18］表明地衣芽孢杆菌对部分动物具有促进胃肠道功能、提高免疫力、提高肉鸡的饲料利用率等作用。