高效脱氮降磷菌株的筛选及在工厂化鳗鲡养殖中的应用

朱振兴,江兴龙,刘 勇

(1 集美大学水产学院,福建 厦门 361021;2 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心,福建 厦门 361021)

近年来,随着养殖规模的不断扩大,养殖优质用水的获取越来越困难,已成为水产养殖业健康可持续发展的重要制约因素之一[1-4]。水产养殖废水中含有大量由氮磷元素组成的化合物,这些高浓度的氮磷成分可导致水体的富营养化[5-6]。未经处理的养殖废水排入自然水域会恶化流域内的生态环境,影响水生动植物的生长[7]。解决水产养殖废水的氮磷降解问题对水产养殖业的可持续发展至关重要[8-9]。

好氧反硝化聚磷菌(Aerobic denitrifying phosphorus removing bacteria)是一种新兴的复合型氮磷降解功能菌群,在污废水的处理过程中可对氮磷污染物实现同步处理,可以在真正意义上实现“一碳两用”的作用效果,并大幅提高碳源利用效率[10]。Zhang等[11]以海水养殖池塘的废水为底物,筛选得到一株耐盐聚磷菌BacillussubtilisGHSP10,可有效去除海水养殖污水中的氮和磷。Hou等[12]从养殖水域沉积物中分离得到一株具有氮磷同步降解能力的新型聚磷菌PseudomonaschloritidismutansK14,在最佳条件下,可降解好氧反硝化除磷培养基中99.78%的硝酸盐和超过98%的磷。尽管已有的研究结果表明好氧反硝化聚磷菌在水产养殖中具有良好的效果,但多数的研究主要是使用针对人工配制的半合成/合成液体培养基进行氮磷降解试验而获得的数据。

本研究通过对鳗鲡养殖尾水处理池中采集的淤泥进行分离筛选,获得一株高效好氧反硝化聚磷菌,进行了菌种鉴定和生长曲线测定,并研究其对工厂化鳗鲡精养殖水体中氮磷的降解效果和应用安全性。

1 材料与方法

1.1 好氧反硝化聚磷菌的分离筛选与鉴定

通过MOPS-Glu过磷/限磷筛选试验[13-14]和好氧反硝化聚磷菌的定向驯化,本研究从福建南平鳗鲡养殖场尾水处理池中筛选得到一株高效好氧反硝化聚磷菌。使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取菌株的基因组DNA,以16S rDNA序列的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')为PCR反应引物,使用2 ×TsingKE Master Mix 体系进行PCR 扩增。PCR反应体系为:基因组DNA 1 μL,2 ×TsingKE Master Mix 25 μL,27F Primer(10 μM)1 μL,1492R Primer(10 μM)1 μL,dH2O 22 μL。PCR反应条件为:预变性94 ℃ 10 min,30个循环(94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min),延伸72 ℃ 10 min。PCR产物经纯化后送样至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果上传到NCBI数据库进行BLAST同源序列比对,构建系统发育树,以确定功能菌株的种属信息。

1.2 功能菌株的生长曲线

制备功能菌株的种子液,以无菌 LB液体培养基为本底,加入种子液200 μL,在30 ℃、180 r/min条件下振荡培养41 h,并测量特定培养时刻的OD600。以OD600为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制功能菌株的生长曲线。

1.3 功能菌株氮磷降解最优条件试验

通过单因素控制变量法,研究功能菌株的氮磷降解最优条件。在碳源种类试验中,葡萄糖、红糖(食品级)和淀粉(食品级)分别作为唯一的碳源。在碳氮比试验中,通过改变碳源添加量,将碳氮比调整为 2、4、6、8、10、12。在接种量试验中,通过改变功能菌株种子液的添加量,将接种量调节为0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%。各试验组经对应方法处理后,使用棉花封住瓶口,在30 ℃、180 r/min条件下恒温振荡培养24 h后进行采样,经高速离心后,测量离心后的上清液中总磷和硝酸盐氮的残余量,计算降解率,确定功能菌株氮磷降解最优条件。

1.4 功能菌株对鳗鲡工厂化养殖水质的氮磷降解效果

本底溶液采用集美大学水产试验场鳗鲡工厂化养殖车间养殖水质。本试验的处理组分补充碳源组和无补充碳源组,补充碳源组通过添加无水葡萄糖调节碳氮比至7.9,无补充碳源组不添加任何成分(碳氮比为0.55),扩增培养的功能菌株种子液均以0.5%的接种量一次性接种于1 L的本底溶液中;对照组不添加菌液和碳源。在30 ℃、180 r/min条件下,恒温振荡器内培养。除测定养殖水质本底的总磷和硝酸盐质量浓度外,于水力停留时间在12 h、24 h和48 h立即采集各组样品,30 ℃、10 000 r/min、离心10 min(离心半径9.35 cm),测量离心后的上清液中总磷和硝酸盐氮的残余量,计算降解率。

1.5 功能菌株在美洲鳗鲡工厂化养殖中的应用

应用于工厂化鳗鲡精养殖,以8×107cfu/L的接种量至含0.8 m3水体的养殖美洲鳗鲡(Anguillarostrata)的塑料桶中,对照组不添加功能菌株菌液,设双平行对照试验;处理组和对照组的美洲鳗鲡养殖密度25 kg/m3,平均规格250 g/尾。试验期间,于水力停留时间在0 h、12 h和24 h分别采集各桶养殖水样,测定总磷、硝酸盐氮质量浓度,计算降解率。按1.5%投料率投喂饲料,饲料采用福建天马科技集团股份有限公司生产的鳗鱼黑仔配合饲料,养殖持续30 d,并观察美洲鳗鲡的生长情况。

1.6 水质检测方法

1.7 数据统计分析

每个试验组(对照组)进行3次相同的生物学重复,仪器测量读数进行3次。计算公式如下:

(1)

式中:η为氮磷降解率(%);C1为初始质量浓度(mg/L);C2为最终质量浓度(mg/L)。

(2)

式中:RC/N为碳氮比;CTC为碳源质量浓度(以高锰酸盐指数CODmn计算,mg/L);CTN为氮源质量浓度(以总氮TN计算,mg/L)。

试验数据的统计分析通过统计学软件IBM SPSS Statistics 25进行,并以P<0.05表示差异显著。统计图均采用Origin 2022软件制作。

2 结果

2.1 好氧反硝化聚磷菌的鉴定

BLAST同源序列比对结果显示,本研究筛选得到的功能菌株与Acinetobactertandoiistrain 2pw_2(GenBank登录号:LC191526.1)相似性高达100%。采用MEGA7构建系统发育进化树(Neighbor-Joining法)如图1所示,结果显示菌株PP-1与NCBI数据库现有的4株Acinetobactertandoii16S rDNA序列处于进化树的同一分支且距离最近。将菌株PP-1的16S rDNA序列上传到EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)如图2所示,结果显示菌株PP-1与16S rRNA序列数据库中的Acinetobactertandoiistrain DSM 14970(Accession:KE007359)相似性高达99.93%。结合上述鉴定分析结果,判断菌株PP-1为坦氏不动杆菌(Acinetobactertandoii),并将其命名为坦氏不动杆菌 PP-1。

图1 菌株PP-1的系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree of strain PP-1

2.2 菌株PP-1的生长曲线

菌株PP-1的生长曲线如图3所示。

图3 菌株PP-1的生长曲线Fig.3 The growth curve of strain PP-1

在0～2.5 h内处于生长迟缓期,生长缓慢。培养2.5 h后,曲线以对数形式增长,生长迅速。17.5 h后细胞生长率逐步下降,并开始进入稳定期,在25 h达到生长曲线峰值,菌体总数趋于稳定。培养29 h后,开始进入衰亡期。

2.3 菌株PP-1的氮磷降解最优条件

菌株PP-1的氮磷降解最优条件见表1。根据测定结果可知,当选取葡萄糖作为碳源时,菌株PP-1对总磷和硝酸盐氮的降解率均在60%以上;当碳氮比为8时,菌株PP-1对总磷和硝酸盐氮的降解率最高,分别可达76.24%和83.97%;当接种量为0.5%和0.8%时,菌株PP-1对总磷和硝酸盐氮的降解率也均在60%以上。在接种量最优条件选取方面,虽然菌株PP-1对总磷和硝酸盐氮的降解效果以接种量为0.8%时最优,但其降解率与接种量为0.5%时的降解率相差不大。

因此,综合考虑各单因素试验结果和应用成本,菌株PP-1的最佳应用条件为葡萄糖、碳氮比8和接种量0.5%。

2.4 菌株PP-1对鳗鲡工厂化养殖水质中总磷和硝酸盐氮的降解效果

菌株PP-1对鳗鲡工厂化养殖水质中总磷和硝酸盐氮的降解效果测定结果见表2、表3。据测定结果可知,在添加补充碳源的条件下,菌株PP-1在水力停留时间为12 h、24 h时对鳗鲡养殖水质中的总磷降解率可分别达到56.31%和81.82%;在水力停留时间为12 h、24 h时对鳗鲡养殖水质中的硝酸盐氮降解率可分别达到65.5%和90.37%。另一方面,补充碳源组在水力停留时间为24 h时可使总磷质量浓度从5.008 mg/L降至0.911 mg/L,补充碳源组的总磷降解率均显著高于无补充碳源组44.8%和对照组75.6%(P<0.05);补充碳源组在水力停留时间为24 h时可使硝酸盐氮质量浓度从14.362 mg/L降至1.383 mg/L,硝酸盐氮降解率均显著高于无补充碳源组57.3%和对照组78.9%(P<0.05)。

表2 菌株PP-1对鳗鲡养殖水质中的总磷降解效果测定Tab.2 Determination of total phosphorus degradation effect by strain PP-1 on water quality of Anguilla rostrata culture

表3 菌株PP-1对鳗鲡养殖水质中的硝酸盐氮降解效果测定Tab.3 Determination of nitrate nitrogen degradation effect by strain PP-1 on water quality of Anguilla rostrata culture

2.5 工厂化养殖应用效果

菌株PP-1应用于工厂化养殖,美洲鳗鲡工厂化养殖水质因子浓度变化情况对比如表4所示。结果表明,当水力停留时间在12 h时,添加菌液的处理组鳗鲡养殖水体中的总磷质量浓度从4.97 mg/L降至3.08 mg/L(降解率38%),硝酸盐氮质量浓度从6.27 mg/L降至4.05 mg/L(降解率35.4%);当水力停留时间在24 h时,添加菌液的处理组鳗鲡养殖水体中的总磷质量浓度从4.97 mg/L降至2.05 mg/L(降解率58.8%),硝酸盐氮质量浓度从6.27 mg/L降至2.75 mg/L(降解率56.1%),均具有显著差异(P<0.05)。美洲鳗鲡养殖期间,处理组的总磷和硝酸盐氮质量浓度均显著低于对照组(P<0.05)(图4)。美洲鳗鲡工厂化养殖情况如表5所示。试验期间,美洲鳗鲡健康生长。处理组总质量增加8.2 kg,存活率达99.82%,无发病和异常死亡。表明菌株PP-1应用于工厂化美洲鳗鲡养殖是安全的。

表5 美洲鳗鲡生长情况Tab.5 The conditions ofAnguilla rostrata culture and production

图4 美洲鳗鲡养殖水质因子浓度动态变化情况Fig.4 Dynamic changes in the concentration of water quality factors inAnguilla rostrata culture

3 讨论

3.1 菌株PP-1的最佳培养时间与菌种制备条件

微生物典型生长曲线(Growth curve)对于有效利用和确定微生物的最佳培养时间具有重要参考意义[18]。Li等[19]分离筛选得到一株可降解菲类多环芳烃污染物的坦氏不动杆菌(A.tandoii)LJ-5,研究发现菌株LJ-5在培养24～26 h时,生长量达到最大值。而Wang等[20]对坦氏不动杆菌(A.tandoii)ZM06生长情况的研究也发现,菌株ZM06在最佳条件下的单一培养生长曲线峰值出现于24 h左右。在本研究中,菌株PP-1的生长曲线峰值处于25 h左右,说明其在30 ℃时的最佳培养时间为25±1 h,这与上述研究结果基本吻合。因此,在制备菌株PP-1种子液时,应注意培养时间的选取,并及时保存培养物以保证扩培效果。

3.2 鳗鲡工厂化养殖水质改良效果

利用脱氮降磷功能菌株对养殖水质进行降解修复已逐步成为当前微生物氮磷降解研究领域的热点[21]。该方法不仅能够对水体环境进行氮磷降解,还可提高水生经济动物的免疫力[22]。Wang等[23]在测试氮磷降解功能微生物对南美白对虾养殖的有效性研究中发现,氮磷降解功能微生物可显著降低池塘水体中的氮磷含量(P<0.05),实现南美白对虾的增产。陈翠雪[24]等采用直接泼洒复合微生物菌剂的方式进行海水鱼养殖的原位修复工作,试验期间养殖水体的CODcr、 BOD5、总氮和总磷分别降低61.2%、53.3%、38.1%和27.4%。在本研究中,菌株PP-1在24 h内对鳗鲡工厂化养殖水质中总磷和硝酸盐氮的降解率可分别达到81.82%和90.37%,在相同时间内的氮磷降解率普遍高于现有研究水平[11,12],具备短时间(24 h)内快速降解工厂化养殖水体中总磷和硝酸盐氮的能力,可实现高效快速降低工厂化养殖水体中的氮磷质量浓度。在美洲鳗鲡工厂化养殖期间,美洲鳗鲡健康生长、无病和大规模死亡,这说明菌株PP-1在鳗鲡工厂化养殖水体中能有效降低总磷和硝酸盐氮质量浓度,稳定水质且具有良好的养殖安全性。

3.3 补充碳源对菌株PP-1氮磷降解性能的影响

补充碳源是影响好氧反硝化聚磷菌生长和反硝化聚磷作用过程的关键因素之一[25]。以乙酸钠等为代表的小分子类碳源已逐渐成为好氧反硝化聚磷菌应用研究中常见的碳源种类[26-28],这主要得益于微生物的分解代谢作用与碳源的化学结构和相对分子质量密切相关。相比于其他碳源,小分子类碳源具有更小的相对分子质量,所以在碳源的分解代谢过程中更容易被微生物所利用[29]。然而,由于小分子类碳源普遍存在使用成本过高[30-32]等缺点,很难大规模应用于水产养殖的氮磷降解过程中。与小分子类碳源相比,尽管葡萄糖存在反应速率低等问题,但仍有研究报道了葡萄糖作为好氧反硝化聚磷菌碳源的潜力。吴守中[33]在探究不同碳源对反硝化聚磷菌C18氮磷降解特性影响的实验中发现,当葡萄糖作为补充碳源时,菌株C18的氮磷降解效果与乙酸钠作为碳源时的差别不大。在本研究中,补充碳源组的24 h氮磷降解率均显著高于无补充碳源组(P<0.05),说明以葡萄糖作为补充碳源可显著促进菌株PP-1降解总磷和硝酸盐氮,也间接证明了菌株PP-1属于异养型细菌。

4 结论

通过对坦氏不动杆菌(A.tandoii)PP-1的氮磷降解性能及其在鳗鲡工厂化养殖中的应用效果进行研究,结果显示,当水力停留时间为24 h时,坦氏不动杆菌PP-1的总磷和硝酸盐氮降解率可分别达到81.82%和90.37%,坦氏不动杆菌PP-1具备短时间(24 h)内快速降解工厂化养殖水体中总磷和硝酸盐氮的能力;此外,以葡萄糖作为补充碳源可显著提高坦氏不动杆菌PP-1的降解总磷和硝酸盐氮效果,24 h降解率分别显著提高44.8%和57.3%。坦氏不动杆菌PP-1可在短时间内降解养殖水体中的总磷和硝酸盐。