HPLC法测定度米芬原料的有关物质

陈 聪,刘玉虎,王 磊

1.安徽医科大学附属宿州医院(安徽省宿州市立医院)药剂科, 宿州 234000;2.蚌埠医学院药学院,蚌埠 233030

度米芬是一种阳离子表面活性剂型广谱杀菌剂,具有广泛的抗菌谱及抗菌活性,对革兰阳性和阴性菌及真菌均有较好的杀灭作用[1],主要用于创面、黏膜、皮肤[2]、器械的消毒,亦可用于口腔、咽喉感染的辅助治疗[3]。度米芬现收载于2020年版《中国药典》二部[4],为白色至微黄色片状结晶,化学名为溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十二烷铵一水合物,易溶于乙醇和水,目前市售制剂有度米芬滴丸和度米芬含片,临床应用较为广泛。度米芬现行质量标准仅用滴定法对其所含非季铵类物质进行测定,该方法操作复杂,误差较大,相关的文献也仅限于对度米芬含量进行检测[5-7],未检索到对该制剂有关物质研究的相关报道。该产品及其制剂的用药安全性存在一定风险[8]。本研究结合度米芬原料药生产工艺,确定度米芬原料主要杂质为苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵,结构式见图1。其中苯酚毒性较大,各行各业对其检测方法也在积极探索中[9-16],主要方法以HPLC[17-19]为主。本文用HPLC法对上述4种杂质进行检测,建立度米芬有关物质检测方法,为控制该产品的质量提供数据支持。

图1 各成分化学结构式

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo Scientific U3000液相色谱仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司];Mettler Toledo XS205DU电子天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司];PHS-3W型pH计(上海班特仪器制造有限公司)。

1.2 试药

对照品:度米芬(批号100455-202002,质量分数99.8%)、苯酚(批号100509-202005,质量分数100.0%)来源于中国食品药品检定研究院;N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺(批号13468-02-5,质量分数98.0%)来源于上海毕得医药科技股份有限公司;溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵(批号202005907,质量分数98.0%)、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵(批号20200819,质量分数98.0%)由实验室自制。度米芬原料(批号:20201225、20210317、20210601)来源于重庆青阳药业有限公司;乙腈为色谱纯;其他为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

用Agilent 5TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;以乙腈为流动相A、0.03 mol·L-1磷酸二氢钠+0.01 mol·L-1十二烷基硫酸钠(磷酸调节pH至3.0)为流动相B,流速为1.0 mL·min-1,进行梯度洗脱;检测波长为220 nm;进样量为20 μL;柱温为40 ℃。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液配制

2.2.1稀释剂 取乙腈和水各适量,摇匀,制成乙腈-水(50∶50)的溶液作为稀释剂。

2.2.2对照品储备液 精密称取苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵对照品各适量,用稀释剂溶解并稀释成每1 mL中含上述成分各0.1 mg的杂质混合对照品储备液。精密称取度米芬对照品适量,用稀释剂溶解并稀释成5 mg·mL-1的度米芬对照品储备液。

2.2.3杂质混合对照品溶液 精密吸取2.2.2项下杂质混合对照品储备液适量,用稀释剂稀释成每1 mL中含上述成分各2 μg的杂质混合对照品溶液。

2.2.4系统适用性实验溶液 精密吸取2.2.2项下度米芬对照品储备液4.0 mL、杂质混合对照品储备液0.2 mL置于同一10 mL量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,制成系统适用性实验溶液。

2.2.5供试品溶液 精密称取度米芬原料药适量,用稀释剂溶解并稀释成2 mg·mL-1的供试品溶液。

2.2.6自身对照溶液 精密吸取2.2.5项下供试品溶液1.0 mL置于100 mL量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,制成自身对照溶液。

2.3 系统适用性实验

精密吸取2.2.4项下系统适用性实验溶液20 μL,注入高效液相色谱仪中检测,进行系统适用性实验,记录色谱图,见图1。杂质苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵与度米芬色谱峰以及各杂质间色谱峰分离度均不低于1.5。理论板数按各成分色谱峰计均大于10 000。

2.4 专属性实验

取2.2.5项下供试品溶液作为未破坏供试品溶液;精密称取度米芬原料药20 mg置于10 mL量瓶中,加入1.0 mL的盐酸溶液(1.0 mol·L-1),于80 ℃水浴中加热30 min,取出,冷却至室温,加入1.0 mL的氢氧化钠溶液(1.0 mol·L-1)中和,用稀释剂定容至刻度,摇匀,作为酸破坏供试品溶液。精密称取度米芬原料药20 mg置于10 mL量瓶中,加入1.0 mL的氢氧化钠溶液(1.0 mol·L-1),于80 ℃水浴中加热30 min,取出,冷却至室温,加入1.0 mL的盐酸溶液(1.0 mol·L-1)中和,用稀释剂定容至刻度,摇匀,作为碱破坏供试品溶液。精密称取度米芬原料药20 mg置于10 mL量瓶中,加入稀释剂5.0 mL溶解,于80 ℃水浴中加热8 h,取出,冷却至室温,用稀释剂定容至刻度,摇匀,作为热破坏供试品溶液。精密称取度米芬原料药20 mg置于10 mL量瓶中,加入1.0 mL的过氧化氢溶液(体积分数为3%),于80 ℃水浴中加热30 min,取出,冷却至室温,作为氧化破坏供试品溶液。精密称取度米芬原料药20 mg置于10 mL量瓶中,加入稀释剂5.0 mL溶解,于4 500±500 lx条件下连续光照7 d,取出,冷却至室温,用稀释剂定容至刻度,摇匀,作为光照破坏供试品溶液。

精密吸取上述溶液和空白溶液(稀释剂)各20 μL,注入高效液相色谱仪中检测,记录色谱图。见图2。结果空白溶液对供试品溶液的测定无干扰,酸、碱、高温、氧化和光照等破坏供试品溶液降解杂质峰与度米芬主峰间分离度均大于1.5,主峰纯度因子均大于970,物料平衡符合《中国药典》规定要求。表明所建立的方法专属性良好。

注:1.苯酚;2.N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺;3.未知杂质;4.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵;5.度米芬;6.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵;7.未知杂质。

注:A.空白溶液;B.未破坏供试品溶液;C.酸破坏供试品溶液;D.碱破坏供试品溶液;E.高温破坏供试品溶液;F.氧化破坏供试品溶液;G.光照破坏供试品溶液;1.苯酚;2.N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺;3.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵;4.度米芬;5.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵。

2.5 线性范围考察实验

取苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵对照品各适量,用稀释剂溶解并稀释,制成质量浓度分别为5.22、4.62、4.96、4.34 μg·mL-1的混合溶液,分别精密吸取上述混合溶液0.1、0.5、2.0、5.0、10.0 mL,置于5个25 mL量瓶中,制成系列线性混合对照品溶液。精密吸取上述5种溶液各20 μL,注入高效液相色谱仪中检测,将峰面积与质量浓度进行线性回归,结果见表2。

表2 线性关系考察结果

2.6 检测限和定量限实验

取2.5项下混合溶液用稀释剂逐级稀释,并精密吸取20 μL注入高效液相色谱仪中检测,信噪比S/N约为10时的质量浓度作为定量限,信噪比S/N约为3时的质量浓度作为检测限,计算各成分的检测限和定量限,结果苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵的检测限分别为6.13、4.79、5.26、3.94 ng·mL-1,定量限分别为18.19、12.38、15.34、13.81 ng·mL-1。

2.7 加样回收率实验

精密吸取2.2.2项下杂质混合对照品储备液(苯酚0.105 4 mg·mL-1、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺0.098 6 mg·mL-1、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵0.101 8 mg·mL-1、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵0.094 6 mg·mL-1)1 mL,用稀释剂稀释至10 mL,制成加样杂质混合对照品储备液,备用。精密称取同一批次已知杂质质量分数[溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵质量分数依次为0.0164%、0.0073%,苯酚和N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺均未检出]的度米芬原料药12份,每份20 mg,各置于10 mL量瓶中,随机分成4组,精密加入上述加样杂质混合对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.6 mL,按2.2.5项下供试品溶液制备方法制备,精密吸取上述溶液各20 μL,注入高效液相色谱仪中检测,计算各成分加样回收率及RSD值。苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵的平均回收率分别为99.74%、100.08%、99.19%、98.79%,RSD分别为0.56%、1.12%、0.91%、1.42%。

2.8 溶液稳定性实验

按2.2.5项下方法分别制备供试品溶液,于0、2、5、9、16、24 h依法进样检测,结果供试品溶液中度米芬峰面积RSD值分别为0.37%,总杂质无明显增加;按2.2.3项下方法制备杂质混合对照品溶液,于0、2、5、9、16、24 h依法进样检测,结果杂质混合对照品溶液中苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵峰面积RSD值分别为0.11%、0.49%、0.37%、0.24%。表明该溶液在室温条件下稳定性良好。

2.9 重复性实验

精密称取度米芬原料药20 mg,置于10 mL量瓶中,精密加入2.2.2项下杂质混合对照品储备液0.2 mL,再按照2.2.5项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液,平行制备6份,各精密吸取上述溶液20 μL,注入高效液相色谱仪中检测,结果苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵含量的RSD值分别为0.81%、0.97%、1.24%、0.65%,表明方法的重复性良好。

2.10 中间精密度实验

按照2.9项下溶液制备方法制备供试品溶液,分别考察不同分析实验员、实验日期和实验仪器对精密度的影响。结果在不同分析实验员条件下苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵RSD值(n=12)分别为2.18%、1.46%、0.98%、1.73%;在不同实验日期条件下各成分RSD值(n=12)分别为1.57%、0.98%、0.76%、1.41%;在不同仪器条件下各成分RSD值(n=12)分别为1.88%、1.27%、0.81%、2.34%。所得RSD值均小于10%,表明方法的中间精密度良好。

2.11 耐用性实验

为确保所建立的方法能够适用于常规检验,取2.9项下制备的供试品溶液,分别考察流动相A(±2.0%)、流速(±0.1 mL·min-1)、色谱柱(Agilent 5TC C18、Waters Nova-Pak C18、Dikma Spursil C18)、柱温(±5 ℃)对杂质苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵检验结果的影响,结果待测杂质与相邻色谱峰均能达到有效分离,方法耐用性良好。

2.12 样品测定

取度米芬原料药3批,按2.2项下方法制备供试品溶液,在2.1项色谱条件下进样检测,记录杂质苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵色谱峰面积并计算各杂质成分含量,结果见表3。

表3 3批原料样品测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择

本实验在确定检测波长时,用DAD检测器对度米芬对照品溶液及苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵对照品溶液进行了紫外扫描,发现度米芬和各杂质对照品的最大吸收波长均是220 nm,遂用220 nm作为检测波长运行梯度洗脱程序,可保证检测杂质含量的准确度。

3.2 柱温的选择

在考察色谱条件时,考虑到流动相中缓冲盐浓度较高,温度高可降低色谱柱使用压力,延长色谱柱使用寿命,对柱温进行了考察,在30、35、40、45、50 ℃条件下进样度米芬供试品溶液,发现在柱温为40 ℃时,柱效最好,杂质最少,同时基线最为平稳。最终确定柱温为40 ℃。

本研究根据分析方法验证指导原则[20]对度米芬原料中的苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵的含量进行了方法学考察,建立了度米芬原料中有关物质苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷铵和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷铵同时测定的HPLC法,该方法灵敏度高,专属性强,可用于度米芬原料有关物质的质量控制。