一株产IAA芽孢杆菌ST37对油菜的耐盐促生作用

韦廷舟, 文 怡, 王 超, 王 爽, 陈 云, 张泽颖, 范清锋, 胡琬新, 龙治坚, 江世杰

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010; 2.四川卫生康复职业学院,四川自贡 643000;3.西南科技大学生物质材料教育部工程研究中心,四川绵阳 621010)

土壤盐渍化是造成土地荒漠化的主要原因,严重影响土壤结构和功能,对农业的可持续发展产生不可估量的损失[1-2]。据统计,目前已有20%的耕地受到盐分胁迫,而且盐渍化土壤的面积仍呈现不断增加趋势,预计到2050年全球将有50%的耕地受土壤盐碱化的影响[3]。盐渍化土壤中含有过高的盐分,高盐环境使植物产生渗透胁迫、质膜损伤、离子不平衡等问题,从而阻碍植物的生长[4]。由于盐胁迫对土地和作物的影响日益严重,亟待开发一种高效可行的应对策略解决全球粮食安全问题,传统方法是培育耐盐新品种[5]或是开发转基因耐盐植物[6],但因其效果不佳且在应用过程中存在一定的局限性,亟须寻找一种有效可行的替代策略,近年来通过植物根际促生菌PGPR(plant growth-promoting rhizobacteria)改良盐碱地土壤和提高植物抗逆性已然成为一种有效手段[7]。

植物根际促生菌PGPR是指生存于植物根际土壤中,具有促进植物生长特性的有益微生物[8],也是目前用于盐碱地微生物改良措施中应用最为广泛的微生物,PGPR通过激素促进植物对营养的吸收和利用,从而促进植物的生长[9]。吲哚乙酸IAA(indole-3-acetic acid)是植物内源激素,作用于植物生长发育全过程,影响植物细胞分裂、伸长、分化以及种子萌发、根系发育等诸多过程。除此之外,IAA在植物对盐胁迫等不良环境的响应中也具有重要意义。已有研究表明,从植物根际土壤中分离出产IAA的PGPR能够显著促进植物的生长和发育[10]。从盐碱地、海水等高盐环境分离出的耐盐PGPR能够促进植物在盐胁迫环境中的生长;Li等从盐碱地花生根际土壤中分离出1株能产IAA的阴沟肠杆菌HSNJ4,在模拟盐胁迫条件下,接种HSNJ4菌能够显著增加油菜幼苗的根长、株高、侧根数量以及提高脯氨酸含量、抗氧化酶活性等指标,降低丙二醛含量,从而促进油菜幼苗的生长[11]。此外,PGPR还通过解钾、产铁载体和产ACC脱氨酶等多种方式促进植物生长;解钾菌、溶磷菌通过分解土壤中的难溶性钾、磷、硅等元素,使其转变为易被植物吸收的可溶态的钾、磷、硅等元素[12];产ACC脱氨酶PGPR通过降解乙烯前体物ACC,抑制乙烯的合成,调节植物体乙烯的含量,从而对植物生长起促进作用[13]。周波等从柠条根际土壤中分离出一株具有产铁载体功能的根际促生菌,接种菌株后能使柠条幼苗的株高、根长、鲜质量、干质量分别增长17.25%、6.68%、42.51%和20.67%,这说明具有产铁载体功能的PGPR能够显著促进柠条的生长[14]。因此利用耐盐PGPR来改良盐碱地具有较好的应用前景。

四川省自贡市享有“盐都”之称,其特殊的地质构造孕育了地下丰富的盐卤资源,随着盐矿开采过程中卤水渗漏、矿盐堆积、意外冒卤事件均会导致大面积土壤盐碱化,微生物群落对环境变化极为敏感,随着环境变迁,土壤微生物的适应性进化被驱动,其种类和结构均不同于非盐渍化污染的土壤[14]。因此本研究前期从自贡市长山镇盐矿区周边盐渍化土壤中分离出1株耐盐芽孢杆菌,通过测定其促生特性,在盐胁迫下将其接种于甘蓝型油菜种子,测定种子的发芽率、发芽势及其幼苗的根长和株高,以期为耐盐PGPR的开发和盐碱地的改良提供重要菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验菌株及种子

本研究前期从自贡市荣县长山镇盐矿区污染的植物根际土壤中分离获得一批具有耐盐能力的细菌,经分离纯化保存于笔者所在实验室;大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌WB600作为对照菌株。试验所用甘蓝型油菜种子由四川大学生命科学学院提供。所有试验于2021年11月至2022年3月在四川省绵阳市西南科技大学生物质材料教育部工程研究中心完成。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株ST37的鉴定 将菌株接种于LB固体培养基中过夜活化,参照《常见细菌系统鉴定手册》观察细菌基本特征(包括形态、颜色、边缘、透明度等),并对菌株进行革兰氏染色。提取过夜培养的ST37菌株纯培养物基因组DNA,以此为模板,使用通用引物F27/R1492进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至华大基因测序。获得的16S rDNA序列经NCBI数据库比对分析初步确定物种的分类地位。

1.2.2 菌株ST37的耐盐能力测定 对菌株的耐盐性进行分析,分别以大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌WB600为对照菌株。试验菌株经过夜活化转接于新鲜液体LB培养基中,于30 ℃、200 r/min摇床培养至菌液D600 nm为0.5,分别取培养物1 mL进行梯度稀释(10-1～10-5),每个稀释度分别取10 μL至含有不同浓度NaCl(0、2%、4%、6%)的固体LB培养基表面,于30 ℃培养箱中倒置培养1 d,观察菌株在不同盐胁迫下的生长情况。

1.2.3 菌株ST37对油菜种子萌发的影响 用0.1% HgCl2对油菜种子进行消毒并清洗后,分别置于ST37菌悬液(D600 nm=0.5)和无菌水中浸种1 h,待风干后置于含无菌滤纸培养皿中,每个处理50粒油菜种子,分别加入等体积不同浓度的盐溶液(0、50、100 mmol/L NaCl),以浸泡无菌水的种子为对照组,每个实验组设置5次重复。置于组培室,温度设置为(20±2)℃,光照/黑暗为16 h/8 h处理。保持滤纸湿度,每日统计其发芽数,10 d后统计发芽率,并测定其株高和根长。

发芽率=(发芽种子总数/供试种子总数)×100%;

发芽势=(前3 d发芽种子总数/供试种子总数)×100%。

1.2.4 ST37菌株分泌IAA能力测定 将ST37菌株接种到含有100 mg/L色氨酸的King氏培养基中(以不含色氨酸的King氏培养液为对照),以加 100 μL 无菌水的培养液为空白对照,置于28 ℃、120 r/min的摇床中培养2 d。取培养物 10 000 r/min、4 ℃离心10 min的上清液4 mL,等体积加入比色液混匀,在黑暗中静置0.5 h,立即测定D530 nm值,通过IAA标准曲线计算ST37菌株产IAA的量[15]。按照上述方法,通过在King培养基中添加不同浓度NaCl(0～4%)测定盐胁迫对菌株产IAA能力的影响。

1.2.5 ST37菌株其他促生能力的检测 利用CAS检测液分析菌株产铁载体能力[16];利用含钾长石的解钾培养基检测菌株解钾能力[15];在ADF培养基上连续划线5次分析菌株产ACC脱氨酶能力[15]。

1.3 数据统计

采用MEGA11构建系统发育树,SPSS 26.0对生理指标数据进行统计分析,采用Origin 2017制图。

2 结果与分析

2.1 菌株ST37的鉴定

ST37细菌在固体LB培养基中培养24 h,菌落呈浅黄色、圆形、边缘凸起、表面光滑;经革兰氏染色鉴定ST37菌株为革兰氏阳性菌。提取ST37菌株基因组DNA,以F27/R1492为引物扩增16S rDNA片段,测序获得1 434 bp序列,经NCBI数据库比对分析,鉴定该菌为运动芽孢杆菌(Bacillusmobilis),系统发育分析也显示菌株ST37与运动芽孢杆菌(NR_157731.1)亲缘关系最近(图1)。

2.2 ST37菌株对油菜种子萌发和幼苗生长的影响

通过种子萌发试验研究ST37菌株在不同NaCl胁迫下对油菜种子萌发的影响。结果显示,随着盐胁迫水平的增加,种子发芽率与发芽势随之降低。与未接菌对照相比,接种ST37菌株能够促进种子的萌发。在0、50、100 mmol/L 的盐胁迫下,接种ST37菌株的发芽势比未接菌的分别提高15.00%、6.67%、2.50%;接种ST37菌株的发芽率比未接菌的分别提高0.84%、6.67%、4.40%(图2),表明ST37菌株的接种对油菜种子的萌发具有一定的促进作用。结果显示,接种ST37菌株的油菜株高和根长均高于未接种的对照组的油菜苗株高和根长。

在50、100 mmol/L NaCl处理后,接种ST37菌株的油菜苗株高分别增加了235.40%、217.78%,接种ST37菌株的油菜苗根长分别增加了11.15%和100.00%。以上结果也说明ST37菌株能够显著提高盐胁迫下油菜苗的生物量(图3)。

2.3 ST37菌株的耐盐能力测定

通过比较试验菌株ST37和大肠杆菌DH5α、枯草芽孢杆菌WB600在不同NaCl胁迫下的生长状况,进而评价其耐盐能力(图4)。结果显示,与对照菌株相比,在2% NaCl处理下,菌株ST37和枯草芽孢杆菌WB600生长状况一致,均优于大肠杆菌DH5α;在4%NaCl处理下,ST37菌株耐盐能力强于DH5α而弱于WB600。总体而言,ST37菌株能够耐受2%和4% NaCl 胁迫,具有一定的耐盐能力。

2.4 盐胁迫下菌株ST37产IAA能力

进一步分析ST37菌株在不同NaCl胁迫下产IAA能力,结果显示,ST37菌株产IAA能力随NaCl浓度的增加而显著降低。不加NaCl的正常培养基培养2 d后,其分泌IAA的含量为6.82 mg/L;加入1% NaCl后,ST37菌株产IAA能力显著降低,为不加NaCl对照组IAA含量的57.52%,加入3%～4%NaCl时,其产IAA含量差异不显著,维持在2.15～2.88 mg/L之间,表明ST37菌株在中度盐胁迫下仍具有产IAA的能力(图5)。

2.5 菌株ST37的促生特性分析

微生物除通过分泌IAA之外,还可以通过解钾、产铁载体、产ACC脱氨酶等方式评价其潜在促生能力。由图6结果显示,ST37菌株在含有钾长石的解钾培养基上可产生明显透明圈,说明其具有分解难溶性钾盐的能力;通过与对照相比,ST37菌株的接种导致培养液颜色变红变深,说明该菌具有一定的产铁载体能力;在ADF培养基上连续接种ST37菌株纯培养物5次, 依然可以正常生长, 说明其具有产ACC脱氨酶的能力。基于上述试验结果,表明ST37菌株可能通过产IAA、解钾、产铁载体、分泌ACC脱氨酶等方式使油菜幼苗表现出一定的耐盐促生表型。

3 讨论

本研究试验菌株ST37分离自盐矿区污染的土壤中,高盐环境长期驯化使菌株产生一定的耐盐能力,本研究通过试验验证ST37菌株能够耐受4%的NaCl,经过16S rRNA基因测序初步鉴定ST37菌株是Bacillusmobilis,属于芽孢杆菌属(Bacillus)。目前,关于B.mobilis的研究较少;Korobov等从含有大量除草剂土壤中分离的B.mobilis能够降解2,4,5-三氯苯氧基乙酸,接种该菌9 d后能够降解培养基中62% 的2,4,5-三氯苯氧基乙酸,20 d后能够有效降解土壤中的2,4,5-三氯苯氧基乙酸,去污程度达到58%,说明该菌株能够作为改善土壤农药的去污微生物菌剂[17]。杜慧慧等为寻找高效微生物肥料潜在菌株,从云南多叶树根际土壤中筛选出41株解磷细菌,经过研究发现,B.mobilis是41株解磷细菌中溶磷能力最强的菌株,说明B.mobilis在去污、促生等方面具有一定的潜力[18]。

种子萌发是植物生长周期中最基本和最重要的阶段,也是对盐胁迫最为敏感的时期[8]。土壤中盐分积累导致渗透势增加,不利于种子吸收水分,阻碍种子内部核酸和蛋白质代谢[19],影响内源激素合成,从而抑制种子萌发[20-21]。大量研究表明,在盐胁迫下,接种耐盐PGPR可以促进种子萌发。本研究通过接种ST37菌株能够有效缓解低盐浓度(50 mmol/L NaCl)对油菜种子萌发的毒害作用,对种子的发芽率、发芽势以及株高、根长等均有显著的增益和改善作用。然而在高盐胁迫下,ST37菌株缓解盐胁迫的作用下降或不明显,这与前人的研究结果[22]基本一致。有研究表明,接种耐盐PGPR可以有效促进植物根系对土壤矿质营养物质的吸收和利用,增强植物体内的离子平衡,增加植物种子对水分的吸收和利用能力,从而促进植物种子的萌发;但是过高的盐胁迫会导致种子胚细胞破裂,植物体内代谢失调,造成核酸蛋白合成受阻及毒素积累等,从而导致耐盐PGPR缓解盐胁迫能力下降[23]。

耐盐PGPR通过自身代谢产生植物激素(如IAA等)、分泌ACC脱氨酶、产铁载体等多种促生活性物质,或者具有将难溶性钾、磷转变为植物易吸收的可溶性钾和磷的能力,从而促进植物生长。IAA能促进植物细胞生长,使细胞的体积和质量增加,也是调节植物生长发育全过程的信号物质[24]。研究表明,在处于高盐等逆境条件下,植物自身合成IAA的能力受到抑制,外源IAA的介入能促进植物种子萌发和幼苗生长,从而增强植物对逆境的适应能力[25];Li等从盐碱地获得1株分泌IAA的阴沟肠杆菌能够显著促进油菜幼苗的生长,也证明了PGPR分泌的IAA能显著促进植物的生长[11]。本研究中ST37菌株不仅是中度耐盐菌,而且在不同盐浓度下能分泌IAA,从而在不同盐胁迫下促进植物种子萌发和幼苗的生长,这与前人研究结果基本一致。研究发现,利用可合成ACC脱氨酶的细菌可以增强水稻在盐胁迫下的生长[26];陈小娟等从滨海盐碱地根际土壤样品中分离出2株芽孢杆菌,均具有分泌IAA、产铁载体等促生能力,与施用普通有机肥相比,施用这2株菌的微生物肥料均能显著增加玉米产量[27]。综上,本研究中ST37菌株具有解钾、分泌IAA、产铁载体、产ACC脱氨酶等促生特性,且能在4% NaCl的盐环境中生存,说明该菌株在盐胁迫中具有促进植物生长的潜力,其可能通过以上一种或多种方式促进油菜种子萌发和幼苗生长,然而,对于该菌详细的促生机制有待于进一步探究。

4 结论

本研究菌株ST37经初步鉴定为Bacillusmobilis,具有耐受4% NaCl、产IAA、解钾、产铁载体、产ACC脱氨酶等能力。在盐胁迫下,ST37菌株能够促进油菜种子萌发和油菜幼苗的生长,说明该菌株具有一定的耐盐促生特性。本研究ST37菌株可作为植物促生菌的理想候选菌株,在改善和修复盐碱地方面具有一定的应用潜力。