七方胃痛颗粒对人胃腺癌细胞的抑制作用及可能机制▲

黄旭平 黄菊芳 黎敏航 杨 爽 罗伟生

(1 广西中医药大学附属瑞康医院消化内科,广西南宁市 530011; 2 广西中医药大学研究生院,广西南宁市 530001)

胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一[1],根据国际癌症研究机构的调查,2020年全球新增癌症病例1 930万例,其中胃癌占5.7%,胃癌的新增病例数和死亡病例数在所有癌症中分别位居第5、第3[2]。据GLOBOCAN 2020统计,2020年我国胃癌新增病例约478 508例(男性331 629例,女性146 879例),位居全球第一,约有373 789人死于该病[2]。多数胃癌患者确诊时已错过手术根治时机,因此新辅助化疗成为中晚期胃癌的重要治疗手段,尽管经新辅助化疗后患者总生存期有所改善,但仍然存在较高的复发率[3]。研究显示,人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor,HER)家族由HER1[编码HER1蛋白或表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)]、HER2(编码HER2蛋白)、HER3(编码HER3蛋白)和HER4(编码HER4蛋白)4个密切相关的成员组成,是细胞信号转导的必要条件,可调控细胞分化、增殖、迁移、黏附、修复和血管再生等过程,在肿瘤细胞的增殖和凋亡中起关键作用[4]。HER家族成员在胃癌中往往过度表达与激活,尤其是EGFR和HER2[5]。HER家族蛋白形成自二倍体或异二倍体后,主要通过激活下游磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信号通路,来促进癌细胞增殖,抑制细胞凋亡[6-7]。因此推测HER信号通路是治疗胃癌的关键靶点,如针对HER2的曲妥珠单抗已被证实可显著改善HER2阳性胃癌患者的预后[8]。故本研究选取人胃腺癌细胞系AGS进行体外研究,观察七方胃痛颗粒对AGS细胞凋亡、细胞周期的影响,以及对HER信号通路和下游PI3K/AKT信号通路的影响,为七方胃痛颗粒的基础研究及临床应用提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系 AGS细胞购自上海生命科学院。使用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基,置于37℃、5% CO2培养箱常规培养AGS细胞。

1.2 主要试剂及仪器 七方胃痛颗粒组方包括红参10 g、白术10 g、生黄芪30 g、茯苓10 g、炙甘草9 g、白芍30 g、炒鸡内金10 g、枳实12 g、木香6 g、黄连6 g、吴茱萸3 g、丹参10 g,由广西中医药大学附属瑞康医院制剂室将免煎中药颗粒(江阴天江药业有限公司生产)混匀后灭菌包装,每小袋8 g。顺铂(Sigma-Aldrich Lab &Product Materials公司,批号:MKCM2345),胎牛血清(Gibco公司,批号:10099242C),RPMI-1640培养基(Gibco公司,批号:C11873600CP),青霉素和链霉素(北京索莱宝科技有限公司,批号:20200119、20191108)。Annexin Ⅴ-APC/7-ADD细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司,批号:20201019),细胞周期检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司,批号:20191225),Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,批号:11141ES60],Hieff ® qPCR SYBR® Green Master Mix(No Rox)[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,批号:11184ES08],RIPA高效裂解液和蛋白酶抑制剂(北京索莱宝科技有限公司,批号:20200525、20200110),辣根过氧化物标记的二抗(北京中杉金桥生物有限公司,批号:C0919)。EGFR抗体(批号:AB52894)、HER2抗体(批号:AB134182)、HER3抗体(批号:AB32121)、HER4抗体(批号:AB32375)、AKT抗体(批号:AB179463)、PI3K抗体(批号:AB32089)、β-actin抗体(批号:AB8227)均购自Abcam公司。全自动凝胶成像分析系统(上海培清科技有限公司,型号:JS-380),K2800核酸分析仪(北京凯奥科技发展有限公司),流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company,型号:BD Calibur),实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司,型号:ABI 7500)。

1.3 实验方法

1.3.1 七方胃痛颗粒含药血清的制备:取20只健康清洁级SD大鼠[湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号:SCXK(湘)2020-0002;体重(200±10)g,均为雄性],适应性饲养观察1周。大鼠每日的七方胃痛颗粒用量按成人剂量的0.018倍计算[9]。将七方胃痛颗粒用生理盐水稀释,配制成浓度为2 g/mL的七方胃痛颗粒混悬溶液,然后给予大鼠灌胃处理,剂量为1 mL/100 g,2次/d,连续灌胃5 d,末次灌胃结束后禁食1 h,然后在无菌条件下从腹腔采集静脉血5 mL,静置3～4 h后,4 ℃下3 000 r/min离心20 min,超净台上分离血清,将分离得到的血清置于56 ℃水浴中30 min灭活,用0.22 μm滤器过滤,-70 ℃冷藏备用。后续实验时将血清加入RPMI-1640培养基中,分别配制成含100 mL/L、200 mL/L、300 mL/L (即10%、20%、30%)药物血清的培养基。

1.3.2 实验分组及干预措施:取对数生长期的AGS细胞接种到6孔板中,2 mL/孔,每孔约含3×105个细胞。将AGS细胞随机分为5组[空白对照组、阳性对照组(顺铂组)、10%含药血清组、20%含药血清组、30%含药血清组]。将各组细胞置于37℃、5% CO2培养箱培养24 h后,弃去旧培养基,使用PBS清洗2次。空白对照组加入1 mL RPMI-1640溶液,各含药血清组分别加入1 mL对应浓度含药血清,阳性对照组加入1 mL浓度为4 μg/mL的顺铂[10]。将各组细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱继续培养48 h。

1.3.3 流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期:(1)细胞凋亡检测。取1.3.2干预后的各组细胞,加入0.5 mL 0.25%胰酶(不含乙二胺四乙酸)消化约30 s后收集至离心管中。加入适量PBS轻柔清洗2次,对细胞进行计数后,将其密度调整为约1×106个细胞/mL。取0.5 mL细胞悬液转移到干净的离心管内,37 ℃下1 500 r/min离心5 min后加入500 μL Binding buffer重悬,再加入5 μL Annexin Ⅴ-APC及5 μL 7-AAD,轻柔吹匀后室温下避光反应10 min后,将样本放置在冰上避光保存,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并采用FlowJo软件分析细胞凋亡率。其中Annexin Ⅴ-APC(-)/7-ADD(+)为坏死细胞,主要是实验过程中发生机械损伤的细胞,不纳入计算;Annexin Ⅴ-APC(+)/7-ADD(+)为中晚期凋亡细胞;Annexin Ⅴ-APC(+)/7-ADD(-)为早期凋亡细胞;Annexin Ⅴ-APC(-)/7-ADD(-)为未发生凋亡细胞。总凋亡率=早期凋亡细胞率+中晚期凋亡细胞率。实验重复3次。(2)细胞周期检测。取1.3.2干预后的各组细胞,加入0.5 mL 0.25%胰酶消化约30 s后收集至离心管中,加入适量PBS轻柔清洗2次,对细胞进行计数后,将其密度调整为约1×106个细胞/mL。取1 mL细胞悬液转移到干净的离心管内,4 ℃下1 500 r/min离心5 min后弃上清液,加入500 μL预冷的70%乙醇固定细胞,4 ℃冰箱过夜。4 ℃下1 500 r/min离心5 min后收集细胞,使用PBS洗涤细胞2次后, 再次4 ℃下1 000 r/min离心3 min。然后加入500 μL PBS(含50 μg/mL溴化丙锭,100 μg/mL RNase A,0.2% Triton X-100,预先配置),4 ℃避光孵育30 min。按照标准程序,采用流式细胞仪检测激发波长为488 nm处的荧光反应,采用ModFit软件分析细胞周期分布情况。实验重复3次。

1.3.4 Western blot检测蛋白表达情况:采用RIPA高效裂解液裂解1.3.2干预后的各组细胞,提取细胞蛋白,采用K2800核酸分析仪测定蛋白含量。取30 μg蛋白进行SDS-PAGE,将蛋白样本转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶常温封闭1.0～1.5 h,使用PBST洗涤3次,5 min/次。然后加入β-actin(1 ∶10 000)、EGFR(1 ∶10 000)、HER2(1 ∶1 000)、HER3(1 ∶1 000)、HER4(1 ∶10 000)、AKT(1 ∶10 000)、PI3K(1 ∶1 000)抗体(均为1 μL),4 ℃过夜。使用PBST洗涤3次,5 min/次,然后加入1 μL辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶5 000),常温下脱色摇床摇1 h,PBST洗涤3次,5 min/次。采用二氨基联苯胺显色,凝胶成像系统成像拍照,Image J软件分析蛋白条带灰度值。实验重复3次。

1.3.5 实时荧光定量PCR检测mRNA相对表达水平:使用TRIzol法提取1.3.2干预后的各组细胞总RNA,测定其纯度后,按照试剂盒说明书进行反转录。PCR反应体系包括Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix(No Rox) 10 μL、上游引物 (10 μmol/L)0.4 μL、下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL、cDNA 2 μL、无酶水7.2 μL,总共20 μL。反应条件为95 ℃预变性5 min,95 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(共40个循环)。以β-actin为内参,采用2-△△CT法计算各基因mRNA表达水平。引物序列见表1。实验重复3次。

表1 PCR引物序列

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 七方胃痛颗粒对AGS细胞凋亡的影响 与空白对照组相比,顺铂组AGS细胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及总凋亡率均升高,20%含药血清组AGS细胞的中晚期凋亡率升高,30%含药血清组AGS细胞的中晚期凋亡率及总凋亡率升高(均P<0.05)。见图1和表2。

图1 5组AGS细胞凋亡情况

表2 5组AGS细胞凋亡率的比较(x±s,%)

2.2 七方胃痛颗粒对AGS细胞周期的影响 与空白对照组相比,其他各组细胞的G0/G1期比例升高、S期比例降低,且顺铂组细胞的G2/M期比例降低(均P<0.05),而10%含药血清组、20%含药血清组、30%含药血清组的G2/M期比例与空白对照组相比,差异无统计学意义(均P>0.05)。见图2和表3。

图2 5组AGS细胞周期变化情况

表3 5组AGS细胞周期的比较(x±s,%)

2.3 七方胃痛颗粒对HER信号通路及下游PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响 与空白对照组比较,顺铂组AGS细胞的EGFR、HER2、HER3、HER4、AKT、PI3K蛋白表达水平均下降,10%含药血清组AGS细胞的HER4蛋白表达水平下降,20%含药血清组AGS细胞的EGFR、HER4蛋白表达水平均下降,30%含药血清组AGS细胞的EGFR、HER2、HER3、HER4、AKT、PI3K蛋白表达水平均下降(均P<0.05)。见图3和表4。

图3 5组AGS细胞中HER信号通路及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况

表4 5组AGS细胞HER信号通路及PI3K/AKT信号通路相关蛋白相对表达水平的比较(x±s)

2.4 七方胃痛颗粒对HER信号通路、PI3K/AKT信号通路相关基因表达的影响 与空白对照组相比,顺铂组、10%含药血清组、20%含药血清组、30%含药血清组AGS中的EGFR、HER2、HER3、HER4、PI3K、AKT的mRNA表达水平均下降(均P<0.05)。见表5。

表5 5组AGS细胞HER信号通路、PI3K/AKT信号通路相关基因mRNA相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,绝大多数胃癌属于腺癌,早期可出现上腹胀满不适、嗳气反酸、烧心感等非特异性消化道症状,因与胃炎、胃溃疡等疾病的临床症状相似,易被忽略。中医将胃癌纳入“胃脘痛”“痞满”“噎膈”“反胃”等范畴。《金匮要略》记载“朝食暮吐,暮食朝吐,宿谷不化,名曰胃反”,这与胃癌晚期幽门梗阻的症状较为相似。《济生方》描述“伏梁之状,起于脐下,其大如臂,上至心下,犹梁之横架于胸膈者,是为心积……其病腹热而赤,甚则吐血,令人食少饥瘦”,这与胃癌中期出现的胃痛、食少、呕血、消瘦及癌肿的症状相似。西医认为胃癌与饮食、幽门螺杆菌感染、遗传等因素有关[11]。中医认为胃癌与外因、内因均相关,常因寒温不适、饮食失调、脾胃损伤、忧思郁结、肝失疏泄、脾失健运、胃失和降、日久交阻、湿热互结、气滞血瘀而致癌。由于病期早晚不同,所表现症状不同,在治疗上应重视辨证与辨病、扶正与驱邪、局部与整体相结合的原则[12]。

罗伟生教授结合胃癌的病因、病机及个人长期临床实践,创制七方胃痛颗粒,该方结合了7个经典方剂的特点,取四君子汤之健脾益气、丹参饮之活血化瘀、左金丸之清肝泻火、逍遥散之疏肝解郁、枳实芍药散之行气活血、枳术丸之健脾消痞、木香槟榔丸之行气导滞,纵观全方,肝脾胃同治,同时活血化瘀、行气导滞、清蕴结浊毒,降胃腑之浊气,利脾胃之气[13]。既往研究显示,该方不仅能够抑制AGS细胞发生上皮-间质转化[14],通过影响SGC-7901细胞的Fas/FasL通路促进其凋亡[15],还可以显著降低胃癌Wistar大鼠的病死率[16]。但其抗癌作用的分子生物学机制尚无详细研究。本研究结果显示,七方胃痛颗粒20%含药血清、30%含药血清能提高AGS细胞的中晚期凋亡率(P<0.05),说明七方胃痛颗粒对AGS细胞具有一定的促凋亡作用。

研究表明,EGFR在多种恶性肿瘤细胞的表面过表达,能通过多种途径促进癌细胞的侵袭,是治疗胃癌的重要靶点,同时也是疗效分析及预后评估的重要标志物[17]。肿瘤组织中的一些蛋白因子(如表皮生长因子等)可激活EGFR,活化的EGFR可激活其下游信号通路(如PI3K/AKT信号通路)[18],促进癌细胞的增殖和分化,最终导致肿瘤的发生和肿瘤血管形成[19]。从本研究结果可以看出,一定浓度的七方胃痛颗粒含药血清能直接减少AGS细胞中EGFR基因的转录,降低其蛋白的表达,从源头上抑制该信号通路的激活。HER2是重要的原癌基因,在胃的癌前病变中其表达水平明显升高[20],其编码产物在与自身或其他HER家族蛋白(如HER3等)结合形成同源或异源二倍体后,可进一步激活下游信号通路(如PI3K/AKT信号通路)[21],抑制细胞凋亡及加速细胞周期,从而促进癌细胞的增殖。本研究结果显示,给予七方胃痛颗粒含药血清干预后,AGS细胞周期被阻滞在G0/G1期,而HER2、PI3K、AKT的蛋白表达水平及基因转录水平均降低,说明七方胃痛颗粒具有抑制AGS细胞增殖的作用,作用机制可能是七方胃痛颗粒通过抑制HER2的同源或异源二倍体的形成,从而无法激活下游PI3K/AKT信号通路。HER3在胃癌组织中常过度表达,已被证实对胃癌的进程起到重要作用[22]。本研究结果显示,七方胃痛颗粒30%含药血清可下调AGS细胞的HER3蛋白表达水平(P<0.05),且各浓度的七方胃痛颗粒含药血清均使得AGS细胞的HER3基因转录水平降低(P<0.05),提示七方胃痛颗粒可能通过下调相关基因的转录,进而减少AGS细胞内HER通路相关蛋白的表达,从而起到调控HER信号通路的作用。HER4由HER4基因编码,其通过自体磷酸化参与细胞信号的传递,进而调节细胞的生长与分裂。HER4在多种恶性肿瘤中表达上调,在肿瘤的增殖、转移和耐药等中发挥重要作用,促进胃癌的发生和发展,与胃癌预后密切相关[23]。在本研究中,七方胃痛颗粒含药血清干预后,AGS细胞的HER4蛋白和mRNA 的表达水平均降低,说明调控HER4的表达可能也是七方胃痛颗粒治疗胃癌的机制之一。

综上所述,七方胃痛颗粒能促使AGS细胞发生中晚期凋亡,使细胞周期阻滞在G0/G1期,其可能通过抑制HER信号通路及下游PI3K/AKT信号通路的激活,抑制AGS的增殖。