大蜡螟幼虫肠道微生物聚乙烯降解酶基因的表达及性质分析

柳春雨， 门丽娜， 连雅琴， 张宇宏， 张志伟*， 张伟

（1.山西农业大学林学院，山西 晋中 030801； 2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

聚乙烯（polyethylene，PE）是C、H元素组成，由乙烯为单体进行聚合而成的聚合物，可表示为-[CH2-CH2]n-[1]。聚乙烯具有的饱和线性碳氢链、高拉伸强度、低气体渗透性以及低成本等特性，使其成为应用最广泛的塑料品种之一[2-4]。然而，塑料污染对环境和健康构成了严重威胁。微塑料目前已经在全球各个水域都有发现，由于其体积小，鸟类和鱼类很容易摄入并且在体内逐渐累积，最终导致死亡[5-6]，且微塑料在食物链中的富集最终可能对人类健康产生不利影响[7-9]。

在过去的几十年，填埋[10]和热处理[11]是塑料废物最常用的处理方法。但这些方法会对土壤和大气造成污染，目前常用的塑料垃圾处理方法是机械回收[12]、能源回收[13]和生物降解[14]。相较于其他处理方法，生物降解是一种绿色经济的污染解决途径，在塑料垃圾处理方面显示出明显的优势和前景[15]。生物降解是指在生物和酶的作用下将有机物质转化成简单无机物的过程。聚乙烯的生物降解过程十分复杂，其研究方向主要有两个：一是降解聚乙烯微生物的分离纯化并进行解析[16]；二是研究复杂环境中存在的混合降解菌系，如海水、土壤、昆虫肠道微生物等[17]。北京航空航天大学杨军教授团队发现大蜡螟（Galleria mellonellaL.）幼虫可以取食聚乙烯，幼虫肠道微生物作用于塑料，会发生解聚反应[18]。此外，杨军教授团队还顺利从印度谷螟（Plodia interpunctella）幼虫肠道中分离到2株聚乙烯降解细菌，分别是芽孢杆菌YP1和肠杆菌YT1[19]。

尽管聚乙烯降解菌被陆续发现，但其中参与聚乙烯降解的关键酶却较少被报道。目前研究认为聚乙烯降解酶主要有锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶和细胞色素P450酶等[15,20]。这些酶参与聚乙烯降解过程，如末端氧化、链断裂和脂肪酸代谢等[21]，但详细催化机制还需进行深入研究。最近结合量子力学的一项研究表明，利用氧化酶或加氧酶解聚聚乙烯的碳碳键是有可能实现的[22]。因此，本研究基于高通量宏基因组测序技术从大蜡螟的肠道微生物中挖掘到2个过氧化物酶基因，并将其在大肠杆菌中成功表达，对重组酶进行纯化，研究其酶学性质，使用接触角测试法进一步确定其对聚乙烯的降解效率，为生物降解聚乙烯提供了新的依据与思路。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 菌株及质粒 肠道中微生物菌群来源于山西农业大学林学院森林保护实验室饲养的大蜡螟幼虫，该虫种群继代培养20代以上。

大肠杆菌（Escherichia coli）克隆菌株Top10和表达菌株BL21(DE3)购自北京康为世纪生物科技有限公司；pET30a(+)质粒由中国农业科学院生物技术研究所提供。

1.1.2 试剂和材料 试验使用的聚乙烯塑料膜片为中国燕山石化生产的低密度聚乙烯（low density polyethylene，LDPE）膜。DNA聚合酶和同源重组酶购自南京诺唯赞（Vazyme）生物科技股份有限公司；质粒小提试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；过氧化氢购自上海阿拉丁（Aladdin）生化科技股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基 基础无碳源培养基：NaCl (0.005 g·L-1)、MgSO4·7H2O (0.7 g·L-1)、KH2PO4(0.7 g·L-1)、K2HPO4(0.7 g·L-1)、MnSO4·H2O (0.001 g·L-1)、ZnSO4·7H2O (0.002 g·L-1)、 NH4NO3(1.0 g·L-1)，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，最后加入用0.22 µm滤膜过滤的FeSO4·7H2O (0.002 g·L-1)。

1.2 研究仪器

试验仪器包括PCR仪（Bio-Rad 公司）、摇床（江苏太仓市科教器材厂）、超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）、ÄKTATM蛋白纯化仪（美国GE Healthcare公司）、酶标仪（Thermo-354，美国热电公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 大蜡螟幼虫排泄物的收集 将5龄期的大蜡螟幼虫按照饲料组（D组）、塑料组（PE组）、饥饿组（C组）进行饲养，每组3个生物学重复。其中，D组一直饲喂饲料；PE组幼虫只被提供PE塑料膜；C组一直饥饿至研究结束。饲养1周后将幼虫取出空置24 h，然后收集其排泄物进行傅立叶变换红外吸收光谱（fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）分析。

1.3.2 大蜡螟幼虫肠道内容物分析 饲养1周后随机挑选健康的大蜡螟幼虫，解剖出的肠道内容物用1 mL灭菌生理盐水冲洗，-80 ℃冷冻备用。大蜡螟幼虫肠道内容物的宏基因组分析委托北京奥维森基因科技有限公司进行，宏蛋白质组分析委托中国农业科学院蜜蜂研究所进行。

1.3.3 聚乙烯降解关键酶目的片段的扩增 根据组学分析结果预测聚乙烯降解关键酶，并设计酶基因扩增引物(8747-F:inf-CACATGGACAGCC CAGATCTATGAGCACGTCAGACGAGACCAATA;8747-R: TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCCTTCA CGTCAAAACGGTCCAAA；5341-F: AAGAAGGA GATATACATATGATGTCCTTGATTAACACCAAA ATTA;5341-R: CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGA TTTTACCGACCAGATCCAAAGAT)和载体扩增引物(30a-cF:CACCACCACCACCACCACTGAGAT;30a-cR:CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACA AAATT)。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取的大蜡螟幼虫肠道宏基因组DNA作为模板进行PCR扩增，得到2个聚乙烯降解酶POD8747 和AhpC5341的DNA片段，对扩增到的序列片段进行1%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.3.4 重组质粒的构建和诱导表达 通过BglⅡ和NotⅠ 酶切，或PCR方式获得pET30a(+)载体质粒片段，然后经同源重组方式连接目的片段，将连接体系置于50 ℃金属浴中，连接15 min。将连接产物转化E. coliTop10大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有卡纳霉素的LB培养基平板上，37 ℃恒温箱中过夜培养。挑取单菌落进行PCR扩增验证和DNA测序验证，验证正确的菌落即可扩大培养提取得到重组质粒。

将重组质粒pET30a(+)-POD8747、pET30a(+)-Ahpc5341转化入BL21(DE3)表达菌株，涂布于含有卡纳霉素的LB培养基平板上，37 ℃恒温箱中过夜培养，挑取单克隆转接至含有卡纳霉素的LB液体培养基中，37 ℃摇床振荡培养，当OD600nm吸光值为0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol·L-1，16 ℃诱导表达蛋白18~20 h。

1.3.5 重组蛋白纯化 离心收集诱导表达后的菌体，用适量20 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液重悬，超声波破碎细胞壁，破壁菌液经10 000 r·min-1离心10 min后，收集上清液（粗酶液），用装有镍（Ni2+）亲和层析柱的ÄKTATM蛋白纯化仪对粗酶液进行纯化。

1.3.6 重组过氧化氢酶活力测定 将30% H2O2溶液用 0.2 mol·L-1pH 7.0的磷酸缓冲液稀释49倍后得到H2O2工作液，将1 mL 0.2 mol·L-1pH 7.0磷酸缓冲液和0.9 mL H2O2工作液混合均匀，放入37 ℃水浴锅中孵育3 min，然后加入0.1 mL酶液反应5 min，加入32.4 mmol·L-1钼酸铵溶液以钝化过氧化氢酶活性，静置10 min后在405 nm波长下用酶标仪测定光吸收值。1个酶活单位（U）定义为在37 ℃、 pH 7.0条件下每分钟消耗1 µmol H2O2所需要的酶量。

1.3.7 重组酶酶学性质分析 最适温度测定：在50 mmol·L-1pH 7.4 的 Na2HPO4-NaH2PO4底物缓冲液中，于20~90 ℃测试样品过氧化氢酶活力。

最适 pH的测定：在50 ℃条件下，分别在pH 5.0~6.0 (50 mmol·L-1磷酸氢二钠-柠檬酸)、pH 6.0~8.0 (50 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4）、pH 8.0~9.0 (50 mmol·L-1Tris-HCl)、pH 9.0~10.0 (50 mmol·L-1甘氨酸-NaOH)和pH 10.0~11.5 (BR缓冲液-NaOH)的底物缓冲液下测定样品过氧化氢酶活力。

1.3.8 重组酶降解聚乙烯性能分析 将PE膜裁剪成4 cm×4 cm膜片，在75%乙醇溶液中浸泡3 h，取出晾干后在紫外灯下照射1 h，用灭菌超纯水冲洗3次后作为标准PE膜备用。将标准PE膜放入已灭菌的磷酸盐缓冲液中，加入酶液，在37 ℃恒温培养箱中静置7 d，膜取出后用10%的SDS溶液浸泡清洗，然后经超纯水浸泡清洗3次，干燥处理后进行疏水性测试。

1.3.9 蛋白序列分析 使用VectorNTI 11.5软件预测蛋白理论分子量和等电点，使用SignalP-5.0平台（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）分析信号肽，使用BLASTP工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列相似性分析。

2 结果与分析

2.1 大蜡螟幼虫肠道排泄物分析

对大蜡螟幼虫肠道排泄物进行FTIR分析，结果如图1所示。PE组和D组在C-O (1 000 cm-1)和R-OH (3 000~3 500 cm-1)存在特征峰，说明这2组幼虫排泄物存在氧的掺入，发生了生物氧化反应，而C组的幼虫排泄物没有氧的掺入。

图1 大蜡螟幼虫排泄物的傅里叶变换红外光谱分析Fig. 1 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of Galleria mellonella L. larvae frass

2.2 聚乙烯降解酶基因筛选

结合大蜡螟幼虫肠道宏基因组和宏蛋白组数据，构建了聚乙烯降解酶候选基因库（表1），并从中筛选过氧化物酶POD8747和烷基过氧化氢酶AhpC5341进行重组表达和降解性质分析。

表1 聚乙烯降解酶候选基因库Table 1 Candidate gene library of polyethylene degrading enzyme

2.3 目的基因的扩增、载体构建

POD8747蛋白含726个氨基酸，理论分子量为79.4 kD，预测等电点5.09， SignalP 5.0软件预测无信号肽，与来自肠杆菌Enterobacter cancerogenus的过氧化氢酶（登录号WP_006179188）序列相似性达到99%。AphC5341蛋白含187个氨基酸，理论分子量为20.6 kD，预测等电点5.02，SignalP 5.0软件预测无信号肽，与来自肠杆菌属Enterobacter的烷基过氧化氢酶（登录号WP_006177103）序列相似性达到100%。

从大蜡螟幼虫肠道宏基因组中扩增得到了POD8747和AhpC5341基因，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，观察到有明亮单一的特异性条带，POD8747和AhpC5341基因分别为2 181和564 bp（图2）。利用同源重组技术将目的片段连入pET30a(+)载体，并进行测序验证确认。

图2 PCR扩增目的基因核酸电泳分析Fig. 2 DNA electrophoresis analysis of PCR amplified target gene

2.4 聚乙烯降解酶的表达和纯化

将POD8747和Ahpc5341基因连接pET30a(+)载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）后进行诱导表达。2种酶蛋白的理论分子量分别为79.4和20.6 kDa，经SDS-PAGE分析（图3），POD8747和AhpC5341在超声破碎上清液和沉淀中对应目的条带均与理论分子量相符，说明重组蛋白成功在BL21（DE3）中正确表达，但有部分为不可溶性蛋白。经镍亲和层析纯化，在洗脱液中获得纯化后的POD8747和AhpC5341酶蛋白用于后期分析。

图3 聚乙烯降解酶蛋白重组表达和纯化Fig. 3 Recombinant expression and purification of polyethylene degrading enzyme protein

2.5 聚乙烯降解酶酶学性质分析

酶学性质分析结果（图4）表明，POD8747在50 ℃时过氧化氢酶活性最高，温度超过50 ℃后，其活性明显下降；AhpC5341的最适温度也是50 ℃，但其在30~40 ℃仍能维持80%以上的活力。在50 ℃条件下，POD8747和AhpC5341的最适pH均为8.0（图4）。

图4 POD8747和AhpC5341最适温度和最适pHFig. 4 Optimal temperature and optimal pH of POD8747 and AhpC5341

2.6 聚乙烯降解酶处理PE效果分析

使用重组酶液对PE膜处理7 d，通过测试PE膜表面接触角表征塑料。结果（图5）表明，未经处理的PE膜接触角为100°，经POD8747处理后的PE膜接触角为(90.07±3.45)°，经AhpC5341处理后的 PE 膜接触角为(91.73±1.70)°，说明 POD8747和AhpC5341对PE塑料具有降解效果。

图5 PE膜接触角分析Fig. 5 Polyethylene contact angle test

3 讨论

大蜡螟幼虫可以咀嚼PE薄膜，FTIR检测结果显示，幼虫取食塑料后排泄物中出现了含氧官能团的特征峰，表明塑料在幼虫肠道中发生了有氧催化反应。羟基/羧酸基团的增加验证了酶处理PE膜后从疏水到更亲水的表面特性转变，说明PE经幼虫肠道后发生氧的掺入，这与Liu等[23]和Gao等[24]的研究结果一致，再次证明大蜡螟幼虫具有降解PE塑料的能力。

挖掘聚乙烯降解菌株和降解酶的常规方法是先从环境中筛选可培养的降解菌株，然后从中挖掘降解酶[15-16,19-20]。本研究不依赖可培养菌株的筛选，基于大蜡螟肠道宏基因组和宏蛋白组信息，挖掘得到对聚乙烯有降解作用的过氧化物酶POD8747和烷基过氧化氢酶AhpC5341，说明宏组学方法可用于筛选新的聚乙烯降解酶，且后期通过大量数据的筛选，仍有挖掘大量聚乙烯降解酶的潜力。为了确认酶蛋白降解聚乙烯的生物学活力，本研究采用接触角进行活性表征。PE膜表面为疏水结构，降解酶与PE膜接触较为困难，经POD8747和AhpC5341处理后，PE膜接触角变小，说明POD8747和AhpC5341可以催化PE膜表面氧化，进而表面亲水性增加，可促进其他多种降解酶进一步降解PE。研究表明，大多数过氧化物酶的催化机制是相似的，包含3个步骤。首先，在催化循环中产生了具有高能量的Fe(IV)AO，并将其假定为氧化剂来氧化PE薄膜表面，酶对高密度聚乙烯（high density polyethylene, HDPE）表面氧化的机制为在反应开始时，苯酚优先被氧化，随后被分解成相应的苯氧基自由基；其次，苯氧基自由基从聚乙烯链中提取氢，并在高密度聚乙烯链上形成一个表面自由基；最后，形成的自由基（聚乙烯自由基）与空气接触后，迅速转变成过氧化物，然后通过过氧化酶分解将极性基团引入HDPE薄膜[25]。

有研究者在大肠杆菌中克隆了3个烷烃羟化酶基因alkb、alkb1和alkb2，并发现由此产生的重组菌株能够降解低分子量的PE塑料[26]。Sanlnisverdes等[27]使用电子显微镜来分析蜡螟的唾液，并将它们对塑料的降解追溯到2种酚氧化酶，这些酶共同作用在PE塑料表面，几个小时内PE膜产生凹坑并且被氧化，这2种酶被视为对抗塑料降解的新武器，但仍需要其他多种酶的协同作用。本研究筛选到的PE降解酶能够增加PE膜的亲水性，利于其他降解酶与PE膜的接触，这种多酶协同酶系有利于PE的高效降解。

本研究从大蜡螟幼虫肠道内容物宏组学数据中筛选到2个PE降解候选酶，它们具有在PE膜表面定植和降解PE的潜力。通过氧化PE膜增加其亲水性，这有利于其他降解微生物的定植，促进形成细菌、酶和PE膜催化体系。后期通过多种酶的组合作用，有望进一步提高PE膜亲水性，促进多酶协同催化PE塑料的生物降解。