链格孢（Alternaria alternata）在枣、梨和苹果果实上的致病性分化研究

武海燕 李长水 马庆周 尹新明 耿月华 张猛

摘    要：链格孢（Alternaria alternata）可侵染多种果树引起产前及产后果实黑斑病，造成严重的经济损失。不同果树来源的链格孢是否能交互传染还不清楚。本文探讨了引起北方枣、梨和苹果果实黑斑病的链格孢在这3种果实上的致病性分化和交互致病性，明确其交互传染特性。从北方不同地区果园采集枣、梨和苹果的黑斑病病果样品，通过组织分离法进行病原菌的分离， 然后进行纯化及鉴定。利用离体果实接种法对分离到的各个病菌分别在枣、梨、苹果的果实上进行致病性测定，分析了其致病性的差异。结果显示：从3种病果实上共分离出45株链格孢，其中对枣、梨和苹果表现出强致病性的分别为5、11、7株，表现为弱致病的分别为17、8、20株；对3种果实的致病性均在次强等级以上的有6株，致病性均为弱等级的有3株，而在3种果实上致病性等级表现为次强等级以上的菌株有30株，占到总菌株的66.6%。总之，枣、梨和苹果病果上的链格孢存在致病性分化现象，并在这3种果实上是可以交叉侵染致病，互为侵染源。因此，在病害防治方面，临近的不同果园对黑斑病需联防联治。

关键词：链格孢；致病性分化；交互致病性

中图分类号：Q939.5         文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.05.009

Abstract：  Alternaria alternata could infect many kinds of fruit trees and cause black spot disease in fruits before and after production， which would cause serious economic loss. It is not clear whether the pathogens of different fruit trees can interact with each other. In this paper， we studied the pathogenicity differentiation and cross pathogenicity of the fungi that causes black spot in jujube， pear and apple fruits  investigated in northern China.  Black spot fruit samples of jujube， pear and apple were collected from orchards in different areas of north China and the pathogenic fungi were isolated by tissue separation method， then， they were purified and identified. The pathogenicity of each isolated pathogen was determined on the fruits of jujube， pear and apple by in vitro inoculation method， and the difference of pathogenicity was analyzed. The studies showed that 45 strains were isolated from the three kinds of fruits， among which 5， 11 and 7 strains showed strong pathogenicity to jujube， pear and apple， and 17， 8 and 20 showed weak pathogenicity， respectively. There were 6 strains with sub-strong pathogenicity and 3 strains with weak pathogenicity， and there were 30 strains with sub-strong pathogenicity and above on 3 kinds of fruits， accounting for 66.6% of the total strains. In summary，there was pathogenicity differentiation in the pathogens of jujube， pear and apple black spot. They could be cross-infected on these three kinds of fruits， which are mutual infection sources. Therefore， in terms of disease control， joint prevention and treatment are needed in different near by orchards.

Key words： Alternaria alternata; pathogenic differentiation; interactive pathogenicity

鏈格孢（Alternaria alternata）属于半知菌链格孢属（Alternaria），是一种广泛存在于土壤、空气、工业材料、植物上的腐生菌，更是一种重要的植物病原真菌，其寄主范围和地理分布广泛，其导致的病害给农作物的生长和农产品的贮运造成巨大的损失[1-3]。此外，链格孢还是人和其他动物上的重要病原真菌[4-5]。2003年，美国从中国进口的鸭梨中分离到1株检疫性链格孢，使得美国无限制暂停进口中国鸭梨[1]。根据链格孢产寄主专化性毒素（HST）的基因不同，目前已鉴定出7个链格孢菌致病型，其中危害梨和苹果的链格孢分别被定义为日本梨致病型和苹果致病型[6-8]。

文献上引起3种果实黑斑病的主要病原真菌是链格孢（A. alternata （Fr.） Keissler）、细极链格孢（A. tenuissima （Fr.） Wiltshire）、鸭梨链格孢（A. yaliinficiens R.G. Roberts）等。在链格孢现代分类学上，细极链格孢和鸭梨链格孢为非独立物种，属于链格孢的同物异名[9-14]。链格孢可产生链格孢霉毒素（AT）[15-16]，影响果实的产量和品质，并在贮运中导致果品腐烂，造成重大经济损失[17]。近年来，链格孢致病性分化的研究取得较大进展。强胜等[18]对紫茎泽兰的5株链格孢致病性研究表明，其致病性与产毒能力正相关。李雨龙等[19]发现，引起海南飞机草病的链格孢有明显的致病性分化，且对其原寄主飞机草的致病力强于对其他寄主植物的致病力。阎合等[20]对甘草叶斑病菌豆链格孢（A. azukiae）的研究表明，该病菌不仅可以引发甘草叶斑病，还可侵染独活、藤三七、曼陀罗等药用植物，但是对大黄、苍耳等不具侵染性。这些研究均表明，链格孢属的病原菌容易发生致病性分化。

关于在果实生长及贮运过程中，链格孢是否交互感染，以及菌株致病性分化的研究还未见详细报道。本研究从枣、梨、苹果的病果上分离获得大量链格孢菌株，并对其展开致病力及致病性分化的研究，为果树黑斑病的防治和果品的贮运管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病菌：链格孢由郑州、三门峡、洛阳等地区田间和超市的枣、梨和苹果病果样品上分离获得。

接种的果实：枣、梨和苹果品种分别是冬枣、皇冠梨、红富士苹果健康果实。

1.2 方法

1.2.1 病菌的分离 病果上病原菌分离方法参考方中达的组织分离法[21]。将纯化后的病原菌培养在PDA试管斜面，保存在4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 病菌的鉴定 链格孢鉴定时，需将PDA培养基上的小菌块置于PCA培养基上，置于25～28 ℃的生化培养箱中培养。当菌丝覆盖到培养基的3/4时刮去菌丝。3 d后观察记录产孢表型，即孢子成链情况，同时挑取分生孢子梗和分生孢子制作玻片并照相，测量大小。

链格孢的鉴定依据：在分生孢子梗上形成特征性的分生孢子链，不分枝或具有1～5个孢子的侧链（即产孢表型）。分生孢子梗直或弯曲，分隔，淡褐色至褐色，随着连续产孢做合轴式延伸，大小为25.0～100.0 μm×3.5～5.5 μm。分生孢子倒棍棒形或椭圆形，淡褐色至中褐色，成熟分生孢子具有3～9个横隔膜、1～4纵或斜隔膜，孢身20.0～50.0 μm×8.5～15.0 μm，假喙3.5～29.0 μm×2.0～4.5 μm[12，14，22]。

1.2.3 病菌的接种 将分离鉴定的链格孢培養在PDA平板上，于25 ℃恒温培养箱培养7 d，用灭菌打孔器在菌落边缘打出直径为5 mm的菌饼。

采取针刺方法进行刺伤接种，将菌饼侧接于刺伤处。每个梨和苹果分别接6块菌饼，每个枣接2个菌饼为1个处理，每个处理设3次重复；以刺伤接无菌菌块做空白对照。接种后于25 ℃保湿培养，6 d时测量枣的病斑直径，7 d时测量梨与苹果的病斑直径。病菌致病性等级分级标准参考方中达[21]、台莲梅[23]等方法略加修改[23]，如表1所示。

2 结果与分析

不同寄主分离得到的链格孢其致病性分化及交叉侵染的结果如表2所示。

来自3类果实中的48株链格孢进行交互接种后，菌株的交互致病性有很大的差异。这些菌株对枣、梨、苹果表现出强致病性的菌株数分别为6、11、8株。来自梨的菌株YLL17102610-3、YLL17102610-1对枣的致病性最强，病斑直径均为0.90 cm；来自枣的菌株YLZ17092405对枣的致病性最强，病斑直径为1.55 cm；来自枣的菌株YLZ17101806-1对苹果的致病性最强，病斑直径为1.90 cm。对枣、梨、苹果分别表现为弱致病的菌株数分别为18、9、21株。

对3种果实的致病性均在次强等级以上的有6株，致病性均在中等级以下的有11株，致病性均为弱等级的有3株。对至少一种果实致病性等级表现为次强等级以上的菌株数有30株，占到总菌株的62.5%，说明枣、梨、苹果黑斑病上的链格孢可以对3种果实交叉侵染致病，互为侵染源，致病力也发生了变化，表明链格孢存在一定程度的致病性分化现象。3 讨论与结论

链格孢属真菌在自然界广泛分布，适应性强，繁殖产孢量巨大，对果树危害严重。引起枣、梨、苹果果实黑斑病的病原真菌主要是链格孢（A. alternata （Fr.） Keissler），由于其遗传背景及生存环境的差异，遗传分化明显，导致不同来源的菌株致病性也有所不同。根据一个真菌一个合法名称的原则，细极链格孢（A. tenuissima （Fr.） Wiltshire）和鸭梨链格孢（A. yaliinficiens R.G. Roberts）属于链格孢A. alternata （Fr.） Keissler的同物异名[14]。本研究通过交叉接种不同来源的链格孢，明确了其致病性分化现象。有些菌株在原寄主上致病性表现较弱，但是在其他寄主上表现出较强的致病性，如YLZ17092405菌株其原寄主是枣，但是其对梨表现为强致病性，而对原寄主表现为弱致病性，致病力也发生了明显的变化。

本研究表明，来自3种果实上的链格孢在枣、梨、苹果果实上可交叉侵染致病，但未发现寄主专化型菌株，链格孢在枣、梨、苹果上是否存在寄主专化型需进一步研究。本研究为枣、梨、苹果果实黑斑病侵染规律和综合防控研究提供了理论基础。鉴于链格孢寄主范围广的特点，建议在临近的不同果园需联防联治，在秋季采收后要做好清园杀菌工作。果园里的残果、病果、病叶、枯枝败叶、杂草等都是病菌越冬繁殖的基质，及时清理后，用5波美度石硫合剂进行全园喷雾，清除病菌，降低翌年病害的初侵染菌源，提高防治效果。

参考文献：

[1] 王晋， 王亚茹， 王红宝， 等. 冀中南地区黄冠梨黑斑病病原菌鉴定[J]. 中国果树， 2023（2）： 68-73， 2.

[2] 曹晶， 王海泽， 曹仲根. 秦巴山区拐枣主要病虫害种类调查研究[J]. 现代农业科技， 2022（10）： 59-61.

[3] 杨蕊， 张祺， 石朝阳， 等. 河北省苹果果实黑点病的发病规律及药剂防控研究[J]. 植物病理学报， 2021， 51（6）： 943-950.

[4] LAWRENCE D P， GANNIBAL P B， PEEVER T L， et al. The sections of Alternaria： formalizing species-group concepts[J]. Mycologia， 2013， 105（3）： 530-546.

[5] WOUDENBERG J H C， GROENEWALD J Z， BINDER M， et al. Alternaria redefined[J]. Studies in Mycology， 2013， 75： 171-212.

[6] 王洪秀， 张倩， 王玲杰， 等. 链格孢菌毒素合成相关基因研究进展[J]. 中国生物工程杂志， 2015， 35（11）： 92-98.

[7] TAKAOKA S， KURATA M， HARIMOTO Y， et al. Complex regulation of secondary metabolism controlling pathogenicity in the phytopathogenic fungus Alternaria alternata[J]. New Phytologist， 2014， 202（4）： 1297-1309.

[8] TAKAO K， AKAGI Y， TSUGE T， et al. The global regulator LaeA controls biosynthesis of host-specific toxins， pathogenicity and development of Alternaria alternata pathotypes[J]. Journal of General Plant Pathology， 2016， 82（3）： 121-131.

[9] 康绍兰， 邸垫平， 李兴红， 等. 枣铁皮病病原鉴定[J]. 植物病理学报， 1998， 28（2）： 165-171.

[10] 赵燕， 郭庆元， 王洪凯， 等. 新疆红枣病害种类及田间发生[J]. 新疆农业科学， 2015， 52（3）： 511-516， 589.

[11] 王叶. 枣果实病原真菌的鉴定及链格孢属病原真菌多样性研究[D]. 郑州： 河南农业大学， 2013.

[12] ROBERTS R G. Alternaria yaliinficiens sp. nov. on Ya Li pear fruit： from interception to identification[J]. Plant Disease， 2005， 89（2）： 134-145.

[13] BI Y， LI Y C， GE Y H. Induced resistance in postharvest fruits and vegetables by chemicals and its mechanism[J]. Stewart Postharvest Review， 2007， 3（6）： 1-7.

[14] WOUDENBERG J H C， SEIDL M F， GROENEWALD J Z， et al. Alternaria section Alternaria： species， formae speciales or pathotypes？[J]. Studies in Mycology， 2015， 82： 1-21.

[15] MEENA M， SAMAL S. Alternaria host-specific （HSTs） toxins： an overview of chemical characterization， target sites， regulation and their toxic effects[J]. Toxicology Reports， 2019， 6： 745-758.

[16] 鲁玲玲， 范盈盈， 张锐利. 红枣及其制品链格孢毒素的QuEChERS-UPLC-MS/MS检测方法建立及其污染分析[J]. 食品工业科技， 2022， 43（20）： 337-345.

[17] 王文青， 李扬， 向均， 等. 我国梨产区引起黑斑病的链格孢种类鉴定与致病性研究[J]. 果树学报， 2020， 37（12）： 1922-1933.

[18] 强胜， 常缨， 万佐玺， 等. 采自紫茎泽兰的5个链格孢菌菌株致病性和若干特征的比较[J]. 南京农业大学学报， 2002， 25（4）： 23-27.

[19] 李雨龙， 杨叶， 韦诚， 等. 海南飞机草病原真菌鉴定、致病力测定及其寄主范围分析[J]. 热带作物学报， 2016， 37（1）： 177-182.

[20] 阎合， 徐秉良， 梁巧兰， 等. 甘草叶斑病的發生与病原菌鉴定[J]. 植物保护， 2009， 35（3）： 111-114.

[21] 方中达. 植病研究方法[M]. 3版. 北京： 中国农业出版社， 1998： 122-125.

[22] 张天宇， 张敬泽， 陈伟群， 等. 中国真菌志-第十六卷： 链格孢属[M]. 北京： 科学出版社， 2003： 33-42.

[23] 台莲梅. 马铃薯早疫病菌多样性和侵染过程及品种抗病机制研究[D]. 大庆： 黑龙江八一农垦大学， 2011.

基金项目：国家自然科学基金（31171804）；国家现代农业产业技术体系资助（CARS—27）；植物病虫害生物学国家重点实验室开放基金（SKLOF202103）

作者简介： 武海燕（1973―），女，山东泰安人，实验师，主要从事植物菌物病原研究。

通讯作者简介：耿月华（1984―），山东聊城人，副教授，博士，主要从事植物菌物病害研究。

张猛（1971―），内蒙古包头人，教授，博士，主要从事植物菌物病害研究。