不同试验条件对绵羊冲胚效果的影响

高峰　李心海

摘要 湖羊是江浙地區常见的绵羊品种之一，繁殖性能优越，肉质鲜嫩，营养丰富，为了进一步探索湖羊的繁殖潜力，采用CIDR+PMSG+PG+FSH法对湖羊进行同期发情和超数排卵，并在此基础上对发情母羊进行腹腔镜子宫角输精；采用相同输精密度、不同输精时间（撤栓后48、54、60 h）分别对发情母羊进行腹腔镜子宫角授精，通过冲胚进行卵子受精率和可用胚胎率检查，探究对湖羊进行腹腔镜子宫角输精时的最适输精密度与最适输精时间。结果表明，输精密度为2×10个/mL组的卵子受精率和可用胚胎率显著低于其余4组（P<0.05），其余4组差异不显著（P>0.05）；撤栓后48 h输精组与撤栓后54 h输精组可用胚胎率差异不显著（P>0.05），但均高于撤栓后60 h，且差异显著（P<0.05）；不同输精密度的鲜精以及不同输精时间均会对湖羊卵子受精率和可用胚胎率产生一定的影响，输精密度为3×10个/mL可以作为湖羊鲜精输精的最低有效密度，撤栓后48～54 h输精可以作为湖羊腹腔镜子宫角输精的最佳时间。

关键词输精密度；输精时间；冲胚；胚胎质量；绵羊

中图分类号S826文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）08-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.022开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Different Experimental Conditions on Embryo Flushing Effect of Sheep

GAO Feng，LI Xin-hai（Xuzhou Institute of Biotechnology，Xuzhou，Jiangsu 221000）

Key wordsHu Sheep is one of the common sheep breeds in Jiangsu and Zhejiang regions， with excellent reproductive performance， fresh and tender meat and rich nutrition. In order to further explore the reproductive potential of Hu sheep， CIDR+PMSG+PG+FSH method was used to conduct simultaneous estrus and superovulation of Hu sheep， and on this basis， laparoscopic uterine horn insemination was performed on the estrous ewes; Laparoscopic uterine horn insemination was performed on estrous ewes using the same insemination density and different insemination times （48， 54， and 60 hours after thrombolysis removal）. The fertilization rate and available embryo rate were examined by embryo flushing to explore the optimal infusion precision and time for laparoscopic uterine horn insemination in Hu sheep. The results showed that the fertilization rate and available embryo rate of the 2×10 pieces/mL group were significantly lower than those of the other 4 groups （P<0.05）， while the other 4 groups had no significant difference （P>0.05）;There was no significant difference in the available embryo rate between the 48 h after thrombectomy and the 54 h after thrombectomy groups （P>0.05）， but both were higher than those at 60 h after thrombectomy， and the difference was significant （P<0.05）;fresh semen with different precision and different insemination time have certain influence on fertilization rate and available embryo rate of Hu sheep eggs， 3×10 pieces/mL could be used as the lowest effective density of fresh semen insemination in Hu sheep. 48-54 hours after embolectomy could be the best time for laparoscopic uterine horn insemination in Hu sheep.

Key wordsInfusion precision；Insemination time；Flushing embryo；Embryo quality;Sheep

湖羊是江浙地区常见的绵羊品种之一，繁殖性能优越，肉质鲜嫩，营养丰富，具有早熟、一年四季均可发情、多羔、泌乳性能优良、生长发育速度快、耐热耐湿等优良性状，是一种适宜广泛舍饲的优良品种［1-5］。近年来，随着腹腔镜子宫角输精技术的成熟和发展，优良种畜的利用率越来越受到重视。在技术水平相同条件下，提高种公羊的精液利用率，显得尤为重要。为了进一步利用新技术开发湖羊繁殖优势，该研究探究对湖羊进行腹腔镜子宫角输精时的最适输精密度与最适输精时间，以期为后续湖羊繁殖技术改良提供基础参考，加快湖羊繁殖新技术的推广。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物。试验母羊选择1～2岁龄，体重50 kg 左右，膘情良好，无生殖道疾病，未怀孕的经产湖羊母羊80只。试验公羊选择体格健壮，性欲旺盛，体重60 kg左右，无生殖道疾病的湖羊公羊10只。母羊与公羊分开饲养。

1.1.2药品与仪器。羊用阴道栓（CIDR，南非ZOETIS公司生产），规格：每包20支，每支含0.3 g孕酮；兽用孕马血清（PMSG，宁波三生生物科技有限公司生产），规格：1 000 IU/瓶，批号：110914564；氯前列烯醇（PGF2α，宁波三生生物科技有限公司生产），规格：每支2 mL每支含量0.2 mg，批号：110912207；促卵泡素（FSH，宁波第二激素厂）规格：100 IU/瓶，批号110254629，4 ℃条件保存。

试验仪器包括冲胚管、母羊保定台、恒温水浴锅、腹腔镜、体视显微镜、子宫钳、集精杯、手术剪、医用喷壶、止血钳、注射器、培养皿、手术刀片、医用缝合线、留置针等。

1.2试验方法

1.2.1饲养管理。精料选择全价颗粒料，粗料选择苜蓿、花生秧、秸秆等青贮饲料。每日上、下午各饲喂1次，置自动饮水器饮水。种公羊采精鲜精，活力在0.7以上才可使用。

1.2.2试验动物分组与给药。试验时间：2021年10—11月，试验地点：徐州湖羊养殖基地。

试验发情母羊共80只，均进行同期发情和超数排卵处理，处理过程中不分组。

1.2.3同期发情与超数排卵处理。对所有母羊采用CIDR+PMSG+PG+FSH法进行同期发情和超数排卵处理。埋栓当天记为第1天，每只母羊都埋栓13 d，第11天下午开始肌注FSH，每隔12 h注射1次，连续注射7次，剂量逐渐递减，FSH总剂量为400 IU/只。

1.2.4不同输精密度冲胚效果试验过程。将经过同期发情和超数排卵处理的发情母羊随机分为5组，组别分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组，每组10只，撤栓后48 h进行腹腔镜子宫角授精。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组分别使用不同精液密度的鲜精，依次为2×10、3×10、4×10、5×10、6×10个/mL；每只母羊输入0.2 mL精液，活力在0.7以上。

1.2.5不同输精时间冲胚效果试验过程。将经过同期发情和超排处理的发情母羊随机分为3组，每组10只，采用相同输精密度、不同输精时间进行腹腔镜子宫角授精。根据输精时间分组如下：Ⅰ组（撤栓后48 h）、Ⅱ组（撤栓后54 h）、Ⅲ组（撤栓后60 h）；每只母羊输入0.2 mL精液，活力在0.7以上。

1.2.6腹腔镜子宫角输精。穿刺部位一般选择在母羊乳头下方14 cm左右，腹中线两侧各穿刺1孔，见图1乳头下方黑点所在位置［6-7］。在左侧乳头下方14 cm左右，偏离腹中线左侧3～4 cm 处插入0.7 cm的套管针，刺穿皮肤深度2 cm，将套管送入腹腔。通过套管往腹腔伸入带有冷光源的内窥镜，观察卵巢上排卵点和红体状态以及数量。此时，在右侧相同位置处插入套管针，拔针后通过套管插入输精枪。用输精枪轻轻挑起卵巢，以便观察排卵点和红体。如果卵巢上有多个红体和排卵点时即可输精，若没有排卵点和红体则不必输精。找到子宫角分叉处，在一侧子宫角距离分叉1/3 处，输精枪前端针头刺入子宫角内，应感觉到有阻力，缓慢注射1/2精液量，然后拔出针头，将剩余精液注入另一侧子宫角相应位置，完成输精。

1.2.7胚胎的采集。输精后第6天对供体湖羊采卵。手术前对供体湖羊肌肉注射陆眠宁1 mL/只。在靠近乳房的腹部作一纵行切口，用食指和中指夹住子宫角并拉出腹腔外，生理盐水冲洗，用灭菌的回形针刺破子宫角壁，并从此处插入套管针，将针芯抽出，再用回形针刺破子宫角另一端，并在此处插入冲胚管。用注射器向冲胚管内注入适量水，能够将子宫角撑开，但不能将子宫角壁撑破，在冲胚管的另一端用集卵皿收集胚胎。用注射器吸取生理盐水从套管处注入冲胚，在冲胚管的末端收集冲胚液，然后用注射器将水囊的水抽完，从子宫角抽出冲胚管，冲洗子宫并放回腹腔，缝合腹壁，手术完成后肌肉注射陆醒宁1 mL/只，并肌肉注射青链霉素以防发生感染。

1.2.8检胚。将冲胚液静置10 min，在室温下用体视显微镜放大20倍检胚。先用吸管吸取上清液并弃掉，再用吸管将胚胎转移至另一培养皿中，反复寻找胚胎，将所有胚胎检出。

胚胎质量鉴别依据：胚胎按发育状况和形态可依次分为A、B、C、D 4 个等级。A级，胚胎和胚龄发育阶段吻合、结构紧凑、轮廓清晰、内细胞团完整均匀、透明带光滑均匀、存在极少游离细胞，变性细胞比例少于10%；B級，基本符合胚胎胚龄发育一致、轮廓清晰、内细胞团较完整、透明带较均匀、变性细胞为10%～30%；C级，胚胎与胚胎发育阶段胚龄有差异，色泽与透明度较暗，变性和游离细胞占30～40%；D级，发育停滞、退化或萎缩的胚胎。其中，A级和B级胚胎为可移植胚胎，其妊娠率明显高于C、D 级胚胎。仔细严格检查收集到的胚胎，并且做好胚胎的质量鉴定分级和记录。把同级的胚胎用吸管检出放入内有胚胎保存液的培养皿，在盖上做好标记备用。

1.3数据处理冲胚数包括未受精卵和受精卵形成受精胚胎的总数。受精率=受精胚胎数/冲胚数×100%，可用胚胎率=可用胚胎/受精胚胎数×100%。

用Excel 2003软件记录试验数据并进行整理，用SAS软件中的PROCFREQ程序进行差异显著性检验。

2结果与分析

2.1不同密度鲜精液对供体母羊冲胚的影响由表1可知，不同密度鲜精液对供体母羊腹腔镜子宫角输精后的冲胚结果有一定影响。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组鲜精冲胚数最高为137枚、最低为127枚；受精胚胎数最高为128枚、最低为110枚；卵子受精率最高为93.43%、最低为85.27%。受精胚胎中的可用胚胎数最高为111枚，最低为83枚；可用胚胎率最高为86.72%，最低为75.45%。Ⅰ组（2×108个/mL）与其余各组相比，无论在卵子受精率和可用胚胎率上均存在显著差异（P<0.05），其余各组不存在显著差异（P>0.05）。

2.2不同输精时间对供体母羊冲胚的影响由表2可知，不同输精时间对供体母羊腹腔镜子宫角输精后的冲胚结果有一定影响。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组冲胚数最高为146枚、最低为132枚；受精胚胎数最高为139枚、最低为118枚；卵子受精率最高为95.21%、最低为84.29%。受精胚胎中的可用胚胎数最高为122枚、最低为93枚；可用胚胎率最高为87.77%、最低为78.81%。Ⅲ组（60 h）与其余各组相比，无论在卵子受精率和可用胚胎率上均存在显著差异（P<0.05），其余各组不存在显著差异（P>0.05）。

3讨论

随着腹腔镜子宫角输精技术的成熟和发展，优良种畜的利用率越来越受到重视。在技术水平相同条件下，提高种公羊的精液利用率显得尤为重要。

3.1不同输精密度对绵羊胚胎移植供冲胚的影响试验结果表明，在进行湖羊腹腔镜子宫角输精时可以将精液密度稀释7～10倍，达到3×10个/mL，每只母羊输入0.2 mL，有效精子数0.42亿～0.54亿，其卵子受精率可达91.67%，可用胚胎率达85.95%。一般来讲，绵羊的精液密度为20亿～30亿/mL，每次采精1.5 mL左右。传统的子宫颈输精和阴道人工授精普遍采用3～4倍稀释后，每只母羊输入0.2 mL的精液，这在一定程度上造成了优质精液的浪费，加上传统输精效果有限，就限制了优质精液的利用。刘桂娟等［8］在绵羊人工授精和腹腔镜输精效果比较研究中发现腹腔镜输精受胎率为89.9%，远高于人工授精组的39.2%。苏和等［9］在对美利奴羊、无角陶赛特羊的腹腔镜输精试验中发现腹腔镜输精受精率92.71%，远高于人工授精组的受精率79.33%，并且腹腔镜输精有效精子数0.3亿时，冲胚受精率可达90.83%。毛凤显等［10］在腹腔镜输精对白山羊研究中，采用鲜精有效精子数0.5亿输精，其母羊受精率达到85.71%。魏玉刚［11］将精液稀释5倍采用腹腔镜子宫角输精对卡拉库尔羊进行试验，其受胎率达到89.8%，远高于人工授精组的受胎率70.9%。许文海［12］在对萨福克绵羊进行腹腔镜输精技术研究中也发现，输精密度为3×10个/mL时，其可用胚胎率可达88.2%。从以上研究结果来看，将公羊鲜精进行多倍稀释后，受胎率仍可以达到85%以上，其研究结果与该次试验结果基本一致。由此可见，传统的子宫颈输精和阴道输精虽然操作方法较为简单，但是由于很多客观原因，如阴道和子宫颈弯曲程度和皱褶程度高，精子难以穿过，还容易出现倒流的现象，所以造成传统输精方法受胎率低。相比传统输精方法，腹腔镜输精操作虽然有一定难度，但是经过训练后短时间可以掌握，加之对母羊伤害并不大、受胎率远高于传统输精方法，应该得到大力推广。另外，从试验结果来看，在腹腔镜输精背景下，一定程度上对精液进行高倍稀释，卵子受精率和可用胚胎率都会相应提高，可以节省精液，提高优质公畜精液的利用率。但是，该次试验仅涉及鲜精的使用，对于不同密度冷冻精液对腹腔镜子宫角输精的效果还有待研究。

3.2不同输精时间对绵羊胚胎移植供体冲胚效果的影响分析该次研究结果可知，撤栓后48和54 h的腹腔镜输精在卵子受精率和可用胚胎率上差异不显著，但是要高于撤栓后60 h，且差异显著。高志英等［13］在对多浪羊的研究中发现，撤栓后48 h采用冻精进行阴道输精，受胎率达到24.52%。肖西山［14］在对小尾寒羊的研究中发现，撤栓后48～60 h采用鲜精连续阴道输精2次，受胎率达到68.33%。韩旭飞等［15］在对东北细毛羊的研究中发现，撤栓48 h后，腹腔镜输精受胎率达到89.9%。王晶晶［16］在对美利奴羊的研究中发现，撤栓后48 h腹腔镜输精受胎率达到90%，要远高于撤栓后24、36和72 h。赵霞等［17］在对绵羊腹腔镜输精研究中发现，撤栓后46～58 h获得的受胎率在89.92%～97.44%，远高于其他时间段的受胎率。张静等［18］在对乌珠穆沁羊腹腔镜输精研究中发现，最佳输精时间应在撤栓后48～58 h，受胎率在92.4%～94.8%。综上可知，无论是阴道和子宫颈输精还是腹腔镜输精，输精时间均为36～58 h，与该次试验结果基本一致。绵羊排卵基本发生在发情结束前后，精子维持受精时间在3 d左右，卵子维持受精的时间较短，在5 h左右，而绵羊同期发情大致在撤栓以后的48 h左右。相比传统输精方式，腹腔镜输精节省优质精液的使用量和精子的运行时间。从该试验结果来看，在撤栓后48～54 h输精可以使可用胚胎率达到87.77%，有效地保证输精效果。但是，该试验仅涉及鲜精的使用，对于不同时间段冷冻精液对腹腔镜子宫角输精的效果还有待研究。

4结论

近年来，羊的腹腔镜输精技术得到了飞速的发展，而精液品质的好坏，是此项技术能否成功推广的关键。最佳输精密度和输精时间是推广腹腔镜输精技术、扩大优质公畜利用率关键技术之一。输精密度低，会导致卵子受精率下降；精液密度过高，不仅会浪费优质种质资源，也会造成恶化精子生存环境，降低精液品质。输精时间过早母羊未及时排卵，卵子不够成熟；输精时间过晚卵子会出现退化，同樣难以完成受精作用。该研究通过分析不同输精密度和输精时间对鲜精腹腔镜子宫角输精效果，认为：在腹腔镜子宫角输精技术背景下，湖羊的输精最低输精密度可以设置为3×108个/mL，高于此密度卵子受精率和可用胚胎率并没有大幅度提高，低于此密度会造成下降；最佳输精时间宜在撤栓后48～54 h。通过最低输精密度和最佳输精时间的设置，可以大大提高优秀种公羊的利用率和覆盖面，降低种公羊的饲养规模，从人力、物力等多方面节约成本，给羊场带来更大的经济效益。

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