刺山柑果提取物改善皮肤干燥的机理研究

卢伊娜 刘玉晨 张文环 熊玥

[摘要]目的：通过研究刺山柑果提取物（Capparis spinosa fruit extract，CS）对干燥皮肤的改善作用，来探讨CS在皮肤护理中的作用，同时阐述其对于皮肤丝聚蛋白通路的调控机理。方法：于干燥皮肤上，通过多功能皮肤探头、皮肤胶带取样，检测不同浓度CS即时使用和持续使用下，皮肤含水量、经表皮失水率（Trans-epidermal water loss，TEWL）、鳞屑占比的变化。同时于低湿度环境培养下的重组表皮模型上，采用免疫荧光染色、CCK-8染色、高效液相法，分析CS对于丝聚蛋白降解相关指标的影响。结果：5% CS在使用后4 h可显著提升皮肤含水量，改善皮肤鳞屑占比。使用后7 d，1%、5% CS也可显著提升皮肤含水量，降低TEWL，改善皮肤鳞屑占比。3% CS涂抹于低濕度处理下的重组表皮模型上，4 h时可提升半胱天冬酶14、博来霉素水解酶表达量，促进吡咯烷酮羧酸（Pyrrolidone carboxylic acid，PCA）形成。24 h时改善细胞活力和皮肤结构，恢复皮肤含水量。结论：CS可通过调控丝聚蛋白通路来改善皮肤干燥状态，短时促进丝聚蛋白降解形成PCA，长效改善皮肤结构完整性和屏障功能。

[关键词]刺山柑果提取物；丝聚蛋白；皮肤含水量；经表皮失水率；吡咯烷酮羧酸；皮肤屏障

[中图分类号]R322.99    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）03-0066-04

Abstract： Objective  By studying the improvement effect of Capparis spinosa fruit extract （CS） on dry skin， the role of CS in skin care was discussed， and its mechanism on the filaggrin pathway was described. Methods  On dry skin， multi-probe and skin tape were used to detect the changes of skin hydration， trans-epidermal water loss （TEWL） and scale ratio under immediate and continuous use the different concentrations of CS. On the recombinant epidermis model cultured under a low humidity environment， immunofluorescence staining， CCK-8 staining and high performance liquid phase methods were used to analyze the effect of CS on the degradation of filaggrin. Results  5% CS could significantly increase skin hydration and improve the proportion of skin scales 4 hours after use. 7 days after use， 1% and 5% CS can also significantly increase skin hgdration， reduce TEWL， and improve the proportion of skin scales. Applying 3% CS to the recombinant epidermis model under low humidity can increase the expression of caspase 14 and bleomycin hydrolase and promote the formation of pyrrolidone carboxylic acid （PCA） at 4 h. CS improves cell viability and skin structure and restores skin hgdration within 24 hours. Conclusion  CS can improve skin dryness by regulating the filaggrin pathway， to promote the degradation of filaggrin into PCA in a short time， and improve skin structural integrity and barrier function in a long-term.

Key words： capparis spinosa fruit; filaggrin; skin hydration; TEWL; PCA; skin barrier function

皮肤屏障功能可使体内各种组织和器官免受机械性、物理性、化学性及生物性等损害侵袭和防止机体内各种营养物质、水分、电解质的丧失，正常的皮肤含水量为20%～35%。皮肤含水量较低时，角质层呈现干燥状态，鳞屑增多，而皮肤缺水可能会导致皮肤屏障功能紊乱[1]。丝聚蛋白（Filaggrin，FLG）作为角化包膜的重要组成蛋白，具有智能调控的功能。丝聚蛋白原（pro-FLG）在颗粒层合成，经过一系列水解后可形成FLG单体，与兜甲蛋白、角蛋白等共同形成角化包膜，维持角质层完整性[2-4]。角质层内的FLG又可在半胱天冬酶14、博来霉素水解酶和钙蛋白酶等的作用下被分解成游离的氨基酸形成天然保湿因子（Natural moisturizing factor， NMFs），如吡咯烷酮羧酸（PCA）、尿刊酸等，来调节皮肤水合功能[5-6]。在低湿度环境下，FLG降解相关酶活性在一定时间内增强，以形成更多的NMFs来抵抗干燥对皮肤的影响。

刺山柑（Capparis Spinosa），主要分布在中国新疆和甘肃西部的戈壁沙地。其果实中含有黄酮、多酚、生物碱、皂苷、多糖和蛋白质等成分，具有抗氧化、降血糖、抗肝炎、抗菌及抗炎抗过敏等多种功效[7-9]，但其作用于皮肤，特别是对于干燥皮肤的改善作用并未见报道。本研究将复合酶提取和固相萃取除杂技术应用于刺山柑果活性成分的分离、纯化，最终获得了富含生物碱的刺山柑果提取物（CS），通过干燥皮肤、重组表皮模型来研究其效果及作用机理。

1  材料和方法

1.1 CS制备：将刺山柑果粉碎后，按1：5加入水中提取2 h，复合酶酶解后滤袋过滤。再依次使用硅藻土、聚酰胺树脂、离子交换树脂进行固相萃取除杂，膜过滤后将所得滤液用溶剂再次溶解，即得。CS总生物碱含量大于1.0%。

1.2 试剂：①PCA标准品（上海彩水实业有限公司）；②重组表皮模型Skinovo-Epi、表皮检测试剂盒（杭州捷诺飞生物科技股份有限公司）；③半胱天冬酶14抗体（Abcam公司）；④CCK-8溶液、博来霉素水解酶试剂盒（博士德生物）。

1.3 仪器：①CM-825皮肤水分测试探头﹑TM-300皮肤水分散失测试探头、Visioscan VC98、皮肤脱屑胶带及MPA 6主机（德国CK公司）；②Hydration水分测试探头（丹麦Cortex公司）；③多功能酶标仪FC、二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher公司）；高效液相仪（HPLC，安捷伦公司）；④荧光显微镜（莱卡公司）。

1.4 干燥皮肤试验：于干燥皮肤上分别进行即时使用和持续使用测试。选择小腿部位有一定皮屑的干燥皮肤受试者18名，男女不限。测试期间温度为（20±2）℃，相对湿度为30%～60%。用Hydration水分测试探头检测皮肤含水量，分别重复3次，得出其平均值[10-11]。

1.4.1 即时使用测试：于小腿一侧标记3个区域，面积为3 cm×3 cm，分别为未处理组（空白组）﹑1%和5%的CS组 （样品组），按（2.0±0.1）mg/cm2的用量涂抹一次后，应用Hydration水分测试探头检测使用后4 h各个区域的皮肤含水量，同时采用皮肤脱屑胶带于同一部位剥离4次，采用Visioscan VC98拍摄分析皮肤鳞屑占比[12]。

1.4.2 持续使用测试：于小腿另一侧进行。按每次2～3泵的用量每天早晚使用2次后，应用Hydration、TM-300测试探头分别检测使用后7 d各个区域的皮肤含水量、TEWL，采集皮肤胶带分析鳞屑占比。各指标变化率通过以下公式计算：

变化率=测试指标样品组/测试指标空白组×100%－100%

1.5 重组表皮模型试验[5，13]：将重组表皮模型转移至24孔细胞培养板中，每空700μl，于培养箱中孵育24 h。将CS配制成1%、3%浓度，取25 μl滴加于表皮模型表面，均匀涂抹，分别置于高湿度环境（100%＞湿度＞80%，含水盘）、低湿度环境（20%＜湿度＜40%，不含水盘），于37℃、5% CO2下继续培养4 h、24 h，每组6复孔。培养结束后，收集培养液采用博来霉素水解酶试剂盒进行含量检测。

采用CM-825皮肤探头对重组表皮模型的皮肤含水量进行检测，再每孔加入200μl含CCK-8的染液，37℃孵育40 min，取出染液于酶标仪450 nm处检测吸光度，检测细胞活力变化。皮肤切片进行HE染色。

1.6 免疫荧光染色试验[14]：采用免疫荧光染色法对重组表皮模型冰冻切片的半胱天冬酶14含量进行检测。冰冻切片于室温晾干15～30 min，PBS轻洗2次，每次5 min。加入含0.5% Triton X-100的PBS溶液通透作用15 min后，5%牛血清白蛋白室温封闭1 h。每张切片加入50μl半胱天冬酶14一抗溶液，4℃孵育过夜。再加入50μl荧光二抗溶液室温孵育1 h。每张切片加入50μl含有细胞核染料4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）的封片剂，避光风干后，于正置荧光显微镜上拍照。采用Image软件对荧光强度进行定量分析。

1.7 PCA含量检测试验[15]：采用HPLC分析法对PCA含量进行检测。于重组表皮模型中加入200μl 0.5%的Triton X-100溶液，裂解后备用。采用HPLC进样20μl进行PCA检测，其中色谱柱为ZORBAX SB-C18，流动相为甲醇︰0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液＝2：98，检测时间10 min，检测波长205 nm。依据标准曲线计算PCA含量，变化率计算如前所述。

1.8 统计学分析：采用Prism软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析。以P＜0.05为差异显著，以P＜0.01、P＜0.001为差异极其显著。

2  结果

2.1 即时使用下CS对干燥皮肤的改善作用：使用4 h后，相比于空白组，5% CS处理组皮肤含水量呈现上升，变化率达到29.9%（P＜0.01）。1%、5% CS处理下，3～5级的鳞屑总占比从14.2%分别下降至12.4%、8.1%，变化率分别为-12.6%、-42.8%（P＜0.05）。见图1。

2.2 持续使用下CS对干燥皮肤的改善作用：在持续使用7 d后，相比于空白组，1%、5% CS处理组皮肤含水量均上升，变化率分别达到17.8%（P＜0.001）、38.3%（P＜0.001）；TEWL显著下降，变化率分别达到-18.2%（P＜0.01）、-30.5%（P＜0.01）；鳞屑总占比也下降，3～5级鳞屑总占比分别从14.8%下降至13.6%、12.2%，降低了8.1%、17.6%（P＜0.05）。皮膚鳞屑拍照图显示，1%、5% CS处理下，大鳞屑（浅绿色代表3级、黄色代表4级、红色代表5级）数量明显下降，与分析结果一致。见图2～3。

2.3 CS对低湿度处理下重组表皮模型的作用：采用低湿度培养重组表皮模型模拟干燥环境，研究CS改善皮肤干燥的作用机理。首先检测低湿度培养4 h下CS对重组表皮模型结构和组织活力的影响。低湿度培养4 h时，与高湿度组相比，皮肤结构无明显变化。培养24 h时，角质层明显增厚，表皮层变薄，CCK-8染色结果显示细胞活力下降，皮肤含水量也显著降低。说明长时干燥环境下可影响皮肤组织结构，降低皮肤含水量。而1%、3% CS同步处理24 h时，CCK-8染色液吸光度值从0.3上升至0.5（P＜0.05）、0.6（P＜0.001），分别增长了68.3%、105.8%，皮肤含水量从11.7 AU上升至53.6 AU（P＜0.001）、52.7 AU（P＜0.001），且角质层厚度也降低，接近于高湿度培养下的表皮模型对照。见图4～5。

2.4 CS对重组表皮模型FLG降解的作用：再检测CS对重组表皮模型促进FLG降解成NMFs的关键酶及NMFs代表性成分PCA表达量的影响。低湿度培养4 h时，与高湿度组相比，半胱天冬酶14总荧光强度降低，但博来霉素水解酶表达量从82.3 pg/ml上升至100.8 pg/ml，PCA含量从38.1μg/ml上升至54.9μg/ml，说明较短时的干燥环境可影响FLG降解相关酶的活性，促进NMFs的形成。而3% CS同时处理下，半胱天冬酶14的荧光强度明显上升，变化率达到56.6%（P＜0.01），博来霉素水解酶表达量上升至115.6 pg/ml（P＜0.05），PCA含量上升至53.4 μg/ml（P＜0.05），说明CS在低湿度下处理4 h，可通过上调半胱天冬酶14、博来霉素水解酶的表达，促进FLG降解，产生PCA。低湿度培养24 h时，半胱天冬酶14、博来霉素水解酶、PCA表达量与高湿度相比均升高，而3% CS处理组变化均不明显，但其可改善细胞活性。见图6～7。

3  讨论

刺山柑果提取物对于干燥皮膚的作用及其机理并无文献报道。本研究前期在对保湿相关成分进行筛选时发现水苏碱为甜菜碱结构类似物，具有即时提升皮肤含水量的效果。通过对不同来源富含水苏碱的植物进行保湿验证得知，采取复合酶提取和固相萃取除杂工艺的刺山柑果提取物生物碱提取率最高，且即时提升皮肤含水量的效果最强。因此，最终选用此特定工艺下的刺山柑果提取物进行深入研究。

首先于人体干燥皮肤上验证使用CS不同时间后的改善作用。结果表明，5%的CS即时使用和持续使用，均可显著提升皮肤含水量，降低皮肤鳞屑总占比。于重组皮肤模型上处理4 h时，未发现CS对角质层具有剥脱作用。同时在持续使用7 d时发现，5% CS可显著降低TEWL。通过以上结果，再结合文献[16-18]，推测CS可作用于FLG合成与降解通路，调控皮肤状态。

Cau L等[5]研究发现，在相对湿度为30%～50%的培养条件下，重组表皮模型呈现出角质层变厚、透明角质颗粒增多的结构变化，且经表皮失水率和角质层pH值降低，NMFs量增加。这些结果表明FLG水解程度在干燥处理下增加，参与FLG分解的活性酶如肽基-精氨酸脱亚胺酶活性增强。因此，本研究选择将重组表皮模型进行干燥培养来模拟皮肤干燥的过程，阐述CS对FLG降解的影响。研究结果表明，与低湿度组相比，3% CS处理下，4 h时促进半胱天冬酶14、博来霉素水解酶的表达，提升皮肤组织中PCA的含量。在24 h时，低湿度处理组FLG的降解增多，但组织活力显著下降，角质层增厚，表皮层变薄。而CS处理组FLG降解未见明显变化，但组织活力、角质层厚度、表皮层厚度均有改善，皮肤含水量也显著升高。

对受试者以皮肤含水量80 AU、肉眼可见明显脱屑为界限分成干燥组和较干燥组，再次进行分析可知，1%、5% CS对干燥组的改善效果整体强于较干燥组，推测CS不仅靶向FLG合成与降解的调控，还可对不同干燥人群分级调控，改善不同情况下的皮肤干燥问题。

综上，刺山柑果提取物可作用于FLG的调控通路，在4 h时主要促进FLG降解，增加PCA含量，在24 h时主要改善皮肤组织活力和组织结构，来提升皮肤含水量、降低TEWL，改善皮肤干燥状态。

[参考文献]

[1]Candi E，Schmidt R，Melino G.The cornified envelope：a model of cell death in the skin [J].Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6（4）：328-340.

[2]Kezic S，Jakasa I.Filaggrin and skin barrier function [J].Curr Probl Dermatol，2016，49：1-7.

[3]Thyssen J P，Jakasa I，Riethmüller C，et al.Filaggrin expression and processing deficiencies impair corneocyte surface texture and stiffness in mice [J].J Invest Dermatol，2020，140（3）：615-623.

[4]Hoyer A，Rehbinder E M，F?rdig M，et al.Filaggrin mutations in relation to skin barrier and atopic dermatitis in early infancy [J].Br J Dermatol，2022，186（3）：544-552.

[5]Cau L，Pendaries V，Lhuillier E，et al.Lowering relative humidity level increases epidermal protein deimination and drives human filaggrin breakdown [J].J Dermatol Sci，2017，86（2）：106-113.

[6]Cau L，Pendaries V，Lhuillier E，et al.Skin barrier dysfunction and filaggrin [J].Arch Pharm Res，2021，44（1）：36-48.

[7]Zhang H X，Ma Z F.Phytochemical and pharmacological properties of capparis spinosa as a medicinal plant [J].Nutrients，2018，10（2）：116-118.

[8]Zhou H F，Jian R R，Kang J，et al.Anti-inflammatory effects of caper （capparis spinosa L） fruit aqueous extract and the isolation of main phytochemicals [J].J Agric Food Chem，2010，58（24）：12717–12721.

[9]Vahid H，Bonakdaran S，Khorasani Z M，et al.Effect of capparis spinosa extract on metabolic parameters in patients with type-2 diabetes：A randomized controlled trial [J].Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2019，19（1）：100-107.

[10]Fluhr J，Gloor M，Lazzerini S，et al.Comparative study of five instruments measuring stratum corneum hydration （Corneometer CM 820 and CM 825，Skicon 200，Nova DPM 9003，DermaLab）.Part I.In vitro [J].Skin Res Technol，2010，5（3）：171-178.

[11]盧伊娜，杨雅迪，谢智勇，等.墨藻胶对皮肤水合及屏障功能的促进作用研究[J].日用化学工业，2017，47（12）：709-712.

[12]Khan A.Visio scan VC98，corneometer MPA 5 and tewameter MPA 5[J].Afr J Pharm Pharmaco，2012，6（3）：225-227.

[13]卢伊娜，寻伟，田军.蔓荆子，龙胆，何首乌三种植物复合提取物治疗头皮脂溢性皮炎效果研究[J].中国美容医学，2021，30（1）：77-82.

[14]Pendaries V，Malaisse J，Pellerin L，et al.Knockdown of filaggrin in a three-dimensional reconstructed human epidermis impairs keratinocyte differentiation [J].J Invest Dermatol，2014，134（12）：2938-2946.

[15]Choi H K，Cho Y H，Lee E O，et al.Phytosphingosine enhances moisture level in human skin barrier through stimulation of the filaggrin biosynthesis and degradation leading to NMF formation [J].Arch Dermatol Res，2017，309：795-803.

[16]Choi H K，Cho Y H，Lee E O，et al.Phytosphingosine enhances moisture level in human skin barrier through stimulation of the filaggrin biosynthesis and degradation leading to NMF formation [J].Arch Dermatol Res，2017，309（10）：795-803.

[17]马捷，张学军.丝聚蛋白代谢的相关研究进展[J].中国皮肤性病学杂志，2018，32（9）：3-6.

[18]刘玉超，杨凯业，刘光荣，等.多糖在皮肤领域的应用研究进展[J].中国美容医学，2021，30（7）：182-186.

[收稿日期]2022-04-20

本文引用格式：卢伊娜，刘玉晨，张文环，等.刺山柑果提取物改善皮肤干燥的机理研究[J].中国美容医学，2023，32（3）：66-70.