响应面法优化振荡法提取海鲜菇总黄酮的工艺

李昕霖

摘 要：为了优化振荡法提取海鲜菇总黄酮的工艺条件，提高总黄酮得率，以乙醇为溶剂，设计单因素试验探究料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数对海鲜菇总黄酮得率的影响，并在此基础上进行响应面优化试验。结果表明：在乙醇体积分数为50%、料液比为1∶30、提取温度为59℃、提取时间为2 h条件下，海鲜菇总黄酮得率为3.22 mg·g-1。

关键词：海鲜菇；总黄酮；提取；响应面法

中图分类号：S 646.1   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2023）02-0061-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.010

Abstract： In order to optimize the technological conditions of total flavonoids extracted from Hypsizygus marmoreus by oscillation method and improve the yield of total flavonoids， the single factor experiment was designed with ethanol as the solvent to explore the effects of solidliquid ratio， extraction temperature， extraction time and ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids from Hypsizygus marmoreus， and the response surface optimization experiment was carried out on this basis. The results showed that under the conditions of ethanol volume fraction of 50%， solidliquid ratio of 1∶30， extraction temperature of 59℃ and extraction time of 2 h， the yield of total flavonoids from Hypsizygus marmoreus was 3.22 mg·g-1.

Key words： Hypsizygus marmoreus； Total flavonoids； Extract； Response surface method

海鮮菇Hypsizygus marmoreus又名玉蕈、真姬菇、鸿喜菇（台湾），属担子菌纲、伞菌目、白蘑科、玉蕈属[1]，因具有海鲜的鲜香气味而得名，富含蛋白质、矿物元素，以及氨基酸、多糖、黄酮类等多种活性成分[2-3]，是一种药食兼用的珍稀菇种[4-5]。黄酮类化合物属于植物次生代谢产物，人体不能通过自身合成，具有抗氧化、抗炎杀菌、改善心脑血管血液循环、增强机体免疫能力等作用，且分子量小，容易被人体吸收[6-7]，被广泛应用在保健品、药品方面。

近年来，我国海鲜菇工厂化企业蓬勃发展，鲜菇规模总量不断壮大，但基本以统货方式销售，产品附加值还较低。国内外以食用菌为原料提取黄酮类化合物的研究已成为营养学领域研究热点之一，通常采用的提取方法有溶剂浸提、微波提取、超声波辅助提取、酶辅助提取法、萃取法和振荡法等[8-9]，每种方法各有优缺点。韩秋菊等[10]利用乙醇浸提法提取黑木耳中总黄酮，总黄酮提取率达0.43%；崔福顺等[11]利用超声辅助提取美味牛肝菌中总黄酮，总黄酮提取率达1.36%；王广慧等[12]采用复合酶法从金针菇中提取总黄酮，总黄酮的提取率达4.76%，但采用振荡法提取海鲜菇总黄酮的研究还较少。本研究在前期研究的基础上，以海鲜菇总黄酮得率为指标，结合单因素试验，通过BoxBenhnken响应面法优化振荡法提取海鲜菇总黄酮的工艺条件，以期对海鲜菇加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验以海鲜菇子实体为研究对象，由福建福泉鑫生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与试剂

芦丁标准品、无水乙醇、三氯化铝、醋酸钾等均为分析纯。

101A型恒温鼓风干燥箱（上海捷呈实验仪器有限公司）；SP756P型紫外可见分光光度计（上海沪粤明科学仪器有限公司）；GFSJ8型高效粉碎机（江阴市丰英机械制造有限公司）；SPH103B型恒温培养振荡器（济南禾普仪器设备有限公司）；TGL16MC 台式高速冷冻离心机（长沙湘锐离心机有限公司）。

1.3 单因素试验设计

1.3.1 料液比对海鲜菇总黄酮得率的影响 在提取温度为60℃，乙醇体积分数为60%、提取时间为2.0 h的情况下，分别在1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35的料液比下进行提取。

1.3.2 提取温度对海鲜菇总黄酮得率的影响 在料液比1∶25、乙醇体积分数为60%、提取时间为2.0 h的情况下，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下温度进行提取。

1.3.3 提取时间对海鲜菇总黄酮得率的影响 在提取温度为60℃、料液比1∶25、乙醇体积分数为60%情况下，分别在0.5、1、1.5、2.0、2.5 h提取时间下提取。

1.3.4 乙醇体积分数对海鲜菇总黄酮得率的影响 在提取温度为60℃、料液比1∶25、提取时间为2.0 h的情况下，分别在30%、40%、50%、60% 和70% 乙醇溶液下进行提取。

1.4 响应面法优化

结合单因素试验结果，根据BoxBenhnken中心组合试验设计原理，采用3因素3水平响应面分析方法进行分析[13]，试验因素及水平见表1，固定乙醇体积分数为50%，以料液比（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）3个因素为影响因素，总黄酮得率为响应值，探究海鲜菇总黄酮提取的优化提取参数。

1.5 海鲜菇总黄酮的提取

新鲜成熟的海鲜菇（正常生长120 d左右），于60℃干燥箱烘干，经粉碎机粉碎后过50目筛，得到均一的海鲜菇子实体粉末，保存备用。准确称取1.0 g海鲜菇粉于50 mL容量瓶中，以乙醇为溶剂，在试验设定的料液比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数下进行振荡提取，振荡速率120 r·min-1。以转速4000 r·min-1离心15 min，重复提取1次，合并2次上清液，定容至刻度，得到海鲜菇黄酮提取液[14]。

1.6 总黄酮含量的测定

采用芦丁比色法[15]。

1.6.1 标准曲线的绘制 将干燥后的芦丁标准品配置成溶度为0.3 mg·mL-1的标准溶液，精密移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置6支15 mL的容量瓶中，分别加入2.0 mL三氯化铝溶液，摇匀；加入2.0 mL醋酸钾溶液，摇匀；用30%乙醇定容至刻度，摇匀，于室温静置15 min后测定体系在415 nm处的吸光度，并绘制标准曲线[16]。以浓度C（mg·mL-1）为横坐标， 吸光度Z为纵坐标，得到回归方程为Z=0.5885C+0.0078，R2=0.9991。

1.6.2 总黄酮得率计算 精密吸取1.5中海鲜菇黄酮提取液1.0 mL，其他步骤参考1.6.1，由回归方程计算出待测液中黄酮化合物含量，并按下式计算海鲜菇总黄酮得率。

W=（C×N×V）/M

式中：W表示总黄酮得率（mg·g-1）；C表示总黄酮的浓度（mg·mL-1）；N表示稀释倍数；V表示海鲜菇黄酮提取原液体积（mL）；M表示样品质量（g）

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 料液比对海鲜菇总黄酮得率的影响 由图1可知，当料液比从1∶15提高至1∶30时，海鲜菇总黄酮得率逐渐增大，且在料液比1∶30时达到最大，可能是此时样品中黄酮类化合物溶出量已趋于饱和，但是当料液比继续升高时，会使样品中杂质溶出而影响试验测定[17]。

2.1.2 提取温度对海鲜菇总黄酮得率的影响 由图2可知，当提取温度从40℃升至60℃，海鲜菇总黄酮得率不断增加且变化较大，这可能是温度的增加使海鲜菇黄酮类化合物溶解度增大从而得率增加。当提取温度达到70℃后，总黄酮得率呈缓慢下降趋势，可能是高温使样品中黄酮类化合物分解。

2.1.3 提取时间对海鲜菇总黄酮得率的影响 由图3可知，当提取时间在0.5～2.0 h范围内，随着提取时间的加长海鲜菇总黄酮的得率呈增加趋势，超过2.0 h后总黄酮得率下降。其原因可能是提取时间较短时，黄酮类化合物还没完全溶出，提取时间适当延长有助于提高总黄酮的得率，但当超过一定时间，可能也会破坏黄酮类化合物的分子结构造成得率下降。

2.1.4 乙醇体积分数对海鲜菇总黄酮得率的影响 从图4可知，乙醇体积分数对海鲜菇总黄酮得率的影响相对较小，当乙醇体积分数达到50%时，海鲜菇总黄酮得率达到最大。当乙醇体积分数继续提高时，海鲜菇总黄酮得率略有下降。

2.2 響应面结果分析

海鲜菇总黄酮提取工艺响应面分析试验设计及结果见表2。采用Design Expert 8.0.6软件对表2数据进行多元回归拟合，得到以海鲜菇总黄酮得率为响应值的回归方程式：

Y=3.192-0.03125X1-0.08875X2-0.08X3-0.03X1X2+0.0075X1X3-0.0225X2X3-0.396X12-0.321X22-0.3035X32

2.2.1 回归模型方差分析 由表3可知，失拟项P=0.1415＞0.05，说明差异不显著，模型的F=836.8946且P<0.0001，说明回归模型拟合项高度显著，能通过该近似模型进行后续的优化设计。从F值的大小可以判断，3个因素对响应值Y的影响排序从大到小依次是：X2（提取温度）、X3（提取时间）、X1（料液比）。一次项X1、X2、X3，二次项X12、X22、X32，以及交互项X1X2对响应值Y的影响均极显著（P<0.01），交互项X2X3对响应值Y的影响显著（P<0.05），X1X3对响应值Y的影响不显著。

2.2.2 因素交互作用对海鲜菇总黄酮得率的影响 由图5可知，在固定提取时间（X3）的条件下，随着料液比（X1）或者提取温度（X2）的增加，海鲜菇总黄酮得率呈现先增加而后减少的趋势。响应面坡度陡峭，说明料液比（X1）和提取温度（X2）两因素的交互作用对海鲜菇总黄酮得率影响很显著[18]，和方差分析结果一致。由图6可知，在固定料液比（X1）的条件下，随着提取温度（X2）和提取时间（X3）的提高，海鲜菇总黄酮得率呈先增加后减少的趋势。响应面坡度较陡峭，说明提取温度（X2）和提取时间（X3）两因素的交互作用对海鲜菇总黄酮得率影响显著，和方差分析结果一致。

2.2.3 最佳提取工艺及验证试验 经响应面分析得出，响应面优化提取海鲜菇总黄酮的最佳工艺条件为：料液比1∶29.82、提取温度58.68℃、提取时间1.94 h，该工艺条件下，预测海鲜菇总黄酮得率为3.21 mg·g-1。为满足实际操作，特将海鲜菇总黄酮的最佳工艺参数调整修正为：料液比1∶30、提取温度59℃、提取时间2 h。在该提取条件下，经过6次平行验证试验，测得海鲜菇总黄酮得率的均值为3.22 mg·g-1，与预测值基本接近，说明该方法对预测海鲜菇中总黄酮的实际提取率准确可靠，具有一定应用价值。

3 结论与讨论

单因素试验基础上，通过BoxBenhnken响应面法优化并结合操作实际，得到海鲜菇总黄酮的最佳提取工艺为乙醇体积分数50%、料液比1∶30、提取温度59℃、提取时间2 h，总黄酮得率为3.22 mg·g-1，且各因素对总黄酮得率的影响排序从大到小依次是：提取温度、提取时间、料液比、乙醇体积分数。

调查显示，每年3月、6月海鲜菇鲜品市场菇价波动较大，前两年受新冠疫情的影响甚至出现一家企业就滞销千余吨海鲜菇的情况，因此从海鲜菇中提取功能性成分进而开发高价值产品，不仅仅可以提升产品附加值，更有利于促进行业健康发展。本试验通过响应面优化振荡法提取海鲜菇总黄酮的工艺，该方法经济简单，为海鲜菇进一步加工利用提供了理论依据[19]。

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（责任编辑：柯文辉）