试管苗热处理结合茎尖培养脱除苹果矮化自根砧M9-T337、B9、GM256、M26病毒试验

李帼英 杨俊霞 周代琴

摘 要： 【目的】蘋果矮化自根砧脱毒苗木的推广应用，对推动苹果栽培制度的变革和果业增效、果农增收都具有重要的意义。【方法】对苹果矮化自根砧M9-T337、B9、GM256、M26茎尖和试管苗采用茎尖培养结合试管苗热处理脱除病毒方法，开展了脱毒试验。【结果】经检测，4个苹果砧木苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）茎尖脱毒率为7.1%，苹果茎尖病毒（ASGV）脱毒率为3.6%；二次茎尖热处理后，4个苹果砧木苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）脱毒率为51.0%，达到了预期的目标，对苹果矮化自根砧脱毒苗木的生产起到了促进作用。【结论】对脱毒后的材料送检，4个样品中苹果矮化自根砧M9-T337、TM26不携带苹果茎痘病毒（ASPV）、苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶病毒（ACLSV）、苹果花叶病毒（APMV）、苹果诱果类病毒（ASSVd），病毒的脱毒率达到100%；B9携带苹果茎痘病毒（ASPV），GM256携带苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV），这两种砧木病毒的脱毒率达到80%，脱毒效果较好，该方法可在苗木繁育中推广应用，以促进苹果矮化自根砧脱毒苗木的生产。

关键词： 苹果矮化自根砧；茎尖培养；茎尖；热处理；脱毒

文章编号：2096-8108（2023）02-0012-03  中图分类号：S661.1  文献标识码：A

Experiment on the Removal of M9-T337，B9， GM256， M26 Virus from Apple Dwarf

Self Rootstock by Heat Treatment of Test Tube Seedlings Combined with Stem Tip Culture

LI Guoying， YANG Junxia *，ZHOU Daiqin

（Gansu Tianshui Fruit Research Institute，Tianshui 741002，China）

Abstract： 【Objective】 The popularization and application of virus-free seedlings of apple dwarf rootstock is of great significance to promote the reform of apple cultivation system， increase the efficiency of fruit industry and increase the income of fruit growers. 【Methods】 M9-T337， B9， GM256， M26 shoot tips and test-tube seedlings of apple dwarf rootstocks M9-T337， B9， GM256， M26 were virus-free by shoot tip culture combined with heat treatment of test-tube seedlings. 【Results】The results showed that the virus-free rates of ACLSV and ASGV were 7.1% and 3.6%， respectively.After secondary shoot tip heat treatment， the detoxification rate of apple chlorotic leafhopper virus （ ACLSV ） in four apple rootstocks was 51.0%， which achieved the expected goal and promoted the production of virus-free seedlings of apple dwarf rootstocks. 【Conclusion】 After virus-free material inspection， apple dwarf rootstock M9-T337 and TM26 in the four samples did not carry apple stem pox virus （ ASPV ）， apple stem groove virus （ ASGV ）， apple chlorotic leaf virus （ ACLSV ）， apple mosaic virus （ APMV ） and apple fruit-inducing virus （ ASSVd ）. The virus-free rate reached 100%. B9 carried apple stem pitting virus （ ASPV ）， and GM256 carried apple chlorotic leaf spot virus （ ACLSV ）. The detoxification rate of the two rootstock viruses reached 80%， and the detoxification effect was better. This method can be popularized and applied in seedling breeding to promote the production of virus-free seedlings of apple dwarf rootstocks.

Keywords： apple dwarf self rootstock; stem tip culture; stem tip; heat treatment; detoxification

茎尖培养、热处理脱毒是目前获得植物脱毒材料的重要途径。本试验采用茎尖、试管苗热处理结合二次茎尖培养的方法，开展了苹果品种矮化自根砧木的脱毒试验研究，现将试验结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为天水市果树研究所园内的M9-T337、M26、B9、GM256苹果矮化砧木苗。

1.2 脱毒方法

1.2.1 单纯茎尖培养

在新梢生长最快时期（5月中下旬），选择大田生长健壮的M9-T337、M26、B9、GM256 4个苹果矮化砧木母树，采集生长旺盛、长约2～3 cm顶梢新芽，剪去叶片，放入盛有无菌水的密闭培养瓶内，备用。

1.2.2 材料的清洗和杀菌

将带芽茎段在2‰的84消毒液中浸泡5～ 10 min 后在流水下冲洗2～5 min，放入洗洁精稀释液中清洗5～10 min，后放入脱脂纱布在流水中冲洗1.5～2 h，控干水分后装入干净的烧杯，在超净工作台上用75%酒精浸泡20～30 s，后无菌水冲洗2～3次，然后在0.1%的升汞溶液中处理2～ 6 min ，处理时不断搅动使药液均匀浸到处理材料表面，处理完成后，移到无菌水中冲洗4～5次，用灭菌滤纸吸干材料表面的水分，在解剖镜下迅速剥取 0.4～ 0.5 mm的茎尖进行分离培养，所用培养基为MS+BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+维生素C100 mg/L，培养基添加物为：蔗糖30 g/L、琼脂 5 g/L ，pH=5.8。接种完成后分别标记归类，转入培养室培养，移入培养室的初代培养瓶苗先进行暗培养，用遮光布遮光，温度21～23 ℃，湿度70％～75％，暗培养5～7 d后去掉遮光布，在1 800～2 500 Lx的光照下培养，温度22～24 ℃。

1.2.3 试管瓶苗热处理脱毒

初代培养新芽在20 d左右萌发长到0.5～ 0.8 cm ，此时剪取新芽0.4～0.6 cm转接，转接到MS+6-BA 0.5 mg/L+0.5 mg/L扩繁培养基中培养40 d左右时，剪取2～3 cm的芽转接，每品种接10瓶，每瓶4株。先在室温（24 ℃）条件下培养 15 d ，然后转移到人工气候箱中，光照14 h，黑暗 10 h ，从25 ℃开始每天升高1 ℃，逐渐升温至 32 ℃ ，之后光照38 ℃、黑暗 32 ℃ ，处理20 d。热处理结束后从获得材料嫩梢上剥取0.4～0.5 mm茎尖进行培养。

1.3 病毒检测

1.3.1 初检

对热处理后的瓶苗剪取0.4～0.5 mm顶芽继续转接在扩繁培养基中，以单株为系进行扩繁，苗数达150～200株时，各品种随机抽取5个样本，每个样本10～15株，采用酶联免疫分析法进行苹果茎沟病毒（ASGV）和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）检测。检测各板设阴性、阳性及空白对照，反应结束时用肉眼来观色，阳性样本的颜色应深于阴性对照物，阴性样本的颜色则与阴性对照物相当或浅于阴性对照物。

1.3.2 送检

为了确保获得材料的无毒，将初检获得的材料送中国农科院果树研究所中国落叶果树脱毒中心，利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测方法，检测“苹果茎痘病毒（ASPV）、苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果花叶病毒（ApMV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）五病毒”，最终达到获得苹果脱毒试管苗材料的目的。

2 结果与分析

2.1 单纯茎尖培养

从田间采集4个样品共127个茎尖进行分离培养，成活28个，成活率为22%。采用酶联免疫分析法检测结果显示，直接茎尖培养法脱毒效果很差，仅有2个茎尖脱除了苹果褪绿叶斑病毒，1个茎尖脱除了苹果茎沟病毒，ACLSV脱除率仅为7.1%（见表1）。

2.2 试管苗热处理

由表2可知，将苹果矮化自根砧木M9-T337、M26、B9、GM256茎尖培养的试管苗材料共85芽进行热处理、二次茎尖培养后，成活47个，成活率为  55.2%，经酶联免疫分析法检测，脱毒茎尖24个，ACLSV脱毒率达到51.0%。

2.3 脱毒材料送检及结果

将苹果矮化自根砧木M9-T337、M26、B9、GM256材料各4瓶，送到中国农业科学院果树研究所进行病毒检测。检测报告一式两份，一份交送检单位，一份交由检测单位存档。（检测由结果中国农业科学院果树研究所提供）

2.3.1 检测方法

检测方法采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）

2.3.2 检测结果

由表3检测结果看出，送检样品中苹果矮化砧M9-T337、M26不携带“苹果茎痘病毒（ASPV）、苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果花叶病毒（ApMV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）”所检的4种苹果病毒和1种苹果类病毒；B9携带苹果茎痘病毒（ASPV）、GM256携带苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）。

3 结论

在茎尖脱毒技术中，因外植体大小不同，成活率和脱毒率相互制约，从脱毒這一目标来看，要求茎尖越小越好，但是茎尖太小，自身营养就不足，越难分化，加之切分时的机械损伤，污染率和死亡率也就越高。因此应该综合考虑成活率和脱毒率两个指标，来确定茎尖的大小。结果显示，同一品种不同大小茎尖的污染率、成活率有明显差异。本试验采用茎尖、热处理、二次茎尖脱毒技术，两次切取茎尖为 0.4～ 0.5 mm，降低了切取的操作难度，提高了茎尖的成活率。利用试管瓶苗热处理剪取茎尖脱毒方法 污染率低、周期短，在短时间内即可获得较多脱毒材料。本试验单纯茎尖脱毒成活率为22.0%，脱除苹果茎沟病毒（ASGV）脱除率为36%，苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）的脱毒率为7.1%；试管苗热处理后茎尖培养成活率55.2%，苹果褪绿班病毒（ACLSV）脱毒率为51.0%。对脱毒后的材料送检，4个样品中苹果矮化自根砧M9-T337、M26不携带苹果茎痘病毒（ASPV）、苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果花叶病毒（ApMV）、苹果锈果类病毒（ASSVd），病毒的脱毒率达到100%；B9携带苹果茎痘病毒（ASPV），GM256携带苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV），这两种砧木病毒的脱毒率达到80%，脱毒效果较好，基本上达到了预期的目标。

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