葛根素通过上调Nrf2通路缓解小鼠非酒精性脂肪性肝炎

钟雪晴,李国栋,王可洋,徐 阳

钟雪晴,李国栋,王可洋,徐阳,杭州师范大学附属医院消化内科 浙江省杭州市 310015

0 引言

世界范围内,非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)患病率达到32.4%(95%CI: 29.9%-34.9%)[1].其中10%-20%的NAFLD患者会进展为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH),部分还可能进展为肝硬化或肝癌[1].NAFLD进展为NASH的机制目前并不十分清楚,但炎症和氧化应激起到了很重要的作用.虽然有一些药物对NASH有效,但是这些药物的副作用限制了药物的应用[2].因此,找到一个安全有效的治疗NASH的药物是非常必要的.

葛根素是从葛根中提取的天然活性成分,据报道[3],葛根素有抗炎、抗氧化的功效.葛根素可以调节葡萄糖和脂肪酸的转运,其对高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等代谢性疾病有一定治疗作用[3].也有很多学者探索了葛根素对肝脏脂肪变的调节效果及其机制[4,5],但目前对葛根素改善NASH的确切机制仍不清楚.在本研究中,我们建立了蛋氨酸胆碱缺乏饮食(methionine and choline deficiency diet,MCD)诱导的小鼠NASH模型.我们发现葛根素可以改善小鼠肝脏的脂肪变、炎症、纤维化和氧化应激反应.本实验中,葛根素可上调小鼠肝脏细胞核内转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)以及细胞浆中血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)的表达.我们首次发现,葛根素可能通过上调细胞核内Nrf2的表达,上调其靶基因HO-1从而抑制氧化应激并改善NASH.这为葛根素作为抗NASH的潜在药物提供了进一步的证据.

1 材料和方法

1.1 材料 葛根素购自阿拉丁公司.逆转录试剂盒购自Takara生物公司.兔抗小鼠Nrf2抗体,兔抗小鼠HO-1抗体,HRP抗兔IgG抗体购自ABCAM公司.苏木精-伊红染色试剂盒、天狼猩红染色试剂盒、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司.甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)等试剂盒购自南京建成生物工程研究所公司.肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α,TNFα)及白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒购自生工生物工程公司.

1.2 方法

1.2.1 动物实验: 从上海斯莱克实验动物公司购买了18只雄性C57BL/6小鼠(7 wk-8 wk龄,20 g-25 g),并将其饲养在无特殊病原体动物房中,小鼠可自由进食食物和水.饲料购自南通特洛菲公司.将老鼠适应性喂养正常饮食2 wk,然后,将小鼠随机分为3组,每组6只小鼠,分别喂食正常饮食、MCD饮食或含有0.5% w/w葛根素的MCD饮食4 wk.最后,以水合氯醛麻醉小鼠.收集肝脏和血清用于进一步研究.动物实验方案由杭州师范大学动物实验伦理委员会批准.

1.2.2 组织学检查: 肝脏切片用于常规H&E染色和天狼猩红染色.使用以下评分标准评估肝脏的NAFLD活动评分(nafld activity score,NAS).肝脂肪变性评分从0分到3分:0分,脂肪肝细胞占肝实质的5%以下;1分,脂肪肝细胞占肝实质的6%-33%;2分,脂肪肝细胞占肝实质的34%-66%;3分,脂肪肝细胞占肝实质的66%以上.炎症细胞浸润评分从0分到3分: 0分,无炎症细胞浸润;1分,200倍镜下小于2处炎性细胞浸润;2分,200倍镜下可见2至4处炎性细胞浸润;3分,200倍镜下有大于4处炎性细胞浸润.肝脏气球样变评分从0到2分: 0分,无气球样变;1分,少量气球样变细胞;2分: 许多气球样细胞.

1.2.3 生化检测和Western Blot检测、荧光定量PCR: ALT和AST均采用市售试剂盒测定,小鼠肝脏TG和TC在肝脏匀浆化后用市售试剂盒测定.用市售细胞核蛋白和浆蛋白抽提试剂盒抽提细胞核蛋白和细胞浆蛋白,其中核蛋白用来测定Nrf2的表达,浆蛋白用来测定HO-1的表达.核蛋白用Histone 3蛋白作为内参,浆蛋白用GAPDH作为内参.用Gel-Pro图像分析软件对蛋白质进行定量.从肝脏样品中提取总RNA,然后根据制造商的说明进行实时荧光定量PCR检测mRNA表达.引物列于表1中.基因的相对mRNA表达是通过GAPDH校正获得的.

表1 PCR引物

统计学处理使用Graphpad分析数据.数据以均值±标准差(mean±SD)表示.分别采用单因素方差分析和独立样本t检验法进行多组和两组数据间差异比较.小于0.05的P值被认为具有统计学意义.

2 结果

2.1 葛根素对小鼠体重影响及组织学的影响 我们的研究结果显示,MCD饮食会导致小鼠厌食,模型组小鼠比正常组小鼠进食少,葛根素并没有改善小鼠的厌食情况.喂养MCD饮食4 wk后会降低小鼠体重,葛根素组与模型组小鼠体重无显著性差异.三组小鼠中肝脏指数无显著性差异(图1).小鼠H&E染色中,空泡提示脂肪变.如图2所示,与正常组相比,模型组小鼠肝脏中出现明显的空泡(脂肪变,红色箭头),炎性细胞聚集(黄色箭头)以及纤维化(绿色箭头).饮食中加入葛根素能够明显改善肝脏的脂肪变、炎症和纤维化.天狼猩红染色也证实了葛根素可以改善肝脏纤维化情况(图2).NAS评分显示,模型组小鼠NAS评分显著提高,而葛根素能够显著降低NAS评分情况(表2).

图1 葛根素对蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的NASH小鼠的进食量及体重、肝指数的影响.A: 三组小鼠每日进食量变化;B: 三组小鼠体重变化;C: 三组小鼠肝指数.与正常组相比,cP＜0.001.NASH: 非酒精性脂肪性肝炎.

图2 葛根素对蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎的组织学的影响(400倍镜下).红色箭头: 提示脂肪变;黄色箭头: 提示炎症;绿色箭头: 提示纤维化.H&E: 苏木精-伊红染色.

表2 三组小鼠肝脏NAS评分变化(mean±SD,n=6)

2.2 葛根素对小鼠肝脏脂质的影响 如图3所示,与正常组相比,模型组小鼠肝脏中的甘油三酯和胆固醇含量均显著升高,葛根素能够明显降低肝脏TG和TC的含量.图3显示,与模型组相比,葛根素组肝脏TG含量降低了30.4%(P＜0.01),肝脏TC降低了26.2%(P＜0.05).结果说明葛根素有降低肝脏中脂质含量的作用.

图3 葛根素对NASH小鼠肝脏总甘油三酯和总胆固醇水平的影响(mean±SD,n=6).A: 三组小鼠肝脏中甘油三酯含量;B: 三组小鼠肝脏胆固醇含量.与正常组相比,cP＜0.001;与模型组相比,dP＜0.05,eP＜0.01.NASH: 非酒精性脂肪性肝炎.

2.3 葛根素对肝功能的影响 如图4所示,与正常组比较,模型组小鼠血清ALT显著上升(232.0 U/L±60.8 U/Lvs42.3 U/L±15.9 U/L,P＜0.001);血清AST明显上升(514.2 U/L±150.3 U/Lvs196.3 U/L±61.3 U/L,P＜0.001).本实验证明,葛根素可显著改善肝功能情况.如图4所示,与模型组比较,葛根素组ALT是显著降低的(115.2 U/L±46.4 U/Lvs232.0 U/L±60.8 U/L,P＜0.01),而AST亦是显著降低的(314.7 U/L±112.7 U/Lvs514.2 U/L±150.3 U/L,P＜0.05).实验说明,葛根素可明显改善MCD饮食诱导的肝功能受损情况.2.4 葛根素对炎性因子的影响 本研究检测了血清中的IL-1β和TNFα的水平,并且检测了肝脏中IL-1β和TNFα的mRNA表达水平.如图5所示,与正常组相比,模型组血清中IL-1β(32.17 pg/mL±3.63 pg/mLvs123.50 pg/mL±27.75 pg/mL,P＜0.001)和TNFα(36.83 pg/mL±6.36 pg/mLvs90.67 pg/mL±19.70 pg/mL,P＜0.001)是显著升高的.与模型组相比,葛根素组血清中IL-1β(78.67 pg/mL±18.28 pg/mLvs123.50 pg/mL±27.75 pg/mL,P＜0.01)和TNFα(65.83 pg/mL±11.80 pg/mLvs90.67 pg/mL±19.70 pg/mL,P＜0.01)是明显降低的.实时荧光定量PCR结果(图5C和D)也证明,葛根素可以明显降低肝组织中炎性因子IL-1β和TNFα的mRNA表达水平(P＜0.01).

图4 葛根素对小鼠肝功能的影响.A: 小鼠血清丙氨酸氨基转移酶含量;B: 小鼠血清天门冬氨酸安吉转移酶含量.与正常组相比,cP＜0.001;与模型组相比,dP＜0.05,eP＜0.01.

图5 葛根素对非酒精性脂肪性肝炎小鼠炎症的影响.A: 小鼠血清中TNFα的水平;B: 小鼠血清中IL-1β的水平;C: 小鼠肝脏中TNFα的mRNA相对表达量(内参为GADPH);D: 小鼠肝脏中IL-1β的mRNA相对表达量(内参为GADPH).TNFα: 肿瘤坏死因子α;IL-1β: 白细胞介素1β;GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脱氢酶.与正常组相比,cP＜0.001;与模型组相比,eP＜0.01,fP＜0.001.

2.5 葛根素对肝脏纤维化的影响 如图2所示,天狼猩红染色显示MCD饮食会引起肝脏纤维化,葛根素能够明显改善肝脏纤维化.同时,我们测定了肝脏中纤维化基因(COL1A1、TGFβ、PAI-1和αSMA)mRNA的表达情况(图6).与正常饮食组相比模型组血清中纤维化基因(COL1A1、TGFβ、PAI-1和αSMA)的mRNA表达是显著升高的,葛根素能够明显降低纤维化基因的mRNA水平.

图6 葛根素对肝纤维化基因的影响.A: COL1A1 mRNA相对表达量;B: PAI-1 mRNA相对表达量;C: TGF-β mRNA相对表达量;D:α-SMA mRNA相对表达量.内参为GAPDH.COL1A1: α1-I型胶原蛋白;PAI-1: 纤溶酶原激活物抑制剂-1;TGFβ: 转化生长因子-β;α-SMA:α平滑肌肌动蛋白;GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脱氢酶.与正常组相比,cP＜0.001;与模型组相比,eP＜0.01,fP＜0.001.

2.6 葛根素对氧化应激的影响 MDA能反映脂质过氧化程度,GSH和SOD是抗氧化物质.本实验发现,MCD饮食能够显著降低肝脏中SOD和GSH的活性,并且能够显著升高肝脏中的MDA含量(图7).葛根素能够明显升高肝脏中的SOD和GSH的活性,并且能够明显降低肝脏中的MDA含量(图7).本实验说明,葛根素有抗氧化的作用,能够上调抗氧化物质GSH和SOD的水平,且能够降低脂质过氧化水平.

图7 葛根素对小鼠肝脏氧化应激的影响.A: 小鼠肝脏中每毫克蛋白中谷胱甘肽的水平;B: 超氧化物歧化酶的水平;C: 丙二醛的水平.与正常组相比,cP＜0.001;与模型组相比,dP＜0.05,eP＜0.01.

2.7 葛根素对Nrf2通路的影响 Nrf2是抑制氧化应激反应的关键调节因子,在氧化应激时,游离的Nrf2易位到细胞核并结合到抗氧化酶反应元件上,促进多种抗氧化酶的转录,发挥抗氧化作用[6,7].我们测定了肝脏细胞核内的Nrf2蛋白表达水平,并以Histone 3为内参.如图8所示,模型组小鼠中肝脏细胞的核内Nrf2蛋白表达较正常组稍有升高(1.00±0.08vs1.22±0.14,P=0.073),但两者区别无显著意义.葛根素组小鼠肝脏中Nrf2的蛋白表达较模型组显著升高(3.18±0.29vs1.22±0.14,P＜0.001).葛根素也升高了Nrf2靶基因HO-1的表达.这说明,葛根素能够上调Nrf2通路,发挥抗氧化作用.

图8 小鼠肝脏中核Nrf2及其靶基因HO-1的蛋白表达情况.A: 小鼠肝脏中细胞核内NRF2的蛋白表达水平(以Histone 3)为内参;B: 小鼠肝脏中细胞核内NrF-2蛋白的相对表达水平(以柱状图显示);C: 小鼠肝脏中细胞质蛋白HO-1蛋白表达水平(以GAPDH为内参);D: 小鼠肝脏中细胞质蛋白HO-1蛋白的相对表达水平(以柱状图显示).Nrf2: 细胞核内转录因子NF-E2相关因子2;HO-1: 血红素加氧酶-1;GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脱氢酶.Histone 3: 组蛋白H3抗体.与模型组相比,fP＜0.001.

3 讨论

众所周知,MCD饮食可诱导C57BL/6小鼠出现NASH的典型的病理生理特征.在本研究中,喂养MCD饮食4 wk形成小鼠NASH模型.我们发现,MCD饮食4 wk后小鼠肝脏出现明显的脂肪变、炎症以及纤维化,表明NASH模型复制成功.在MCD饮食中加入葛根素干预,小鼠肝脏中脂肪变、炎症及氧化应激是明显减轻的.结果说明葛根素可以改善NASH.

NASH是NAFLD进展为肝硬化或肝癌的关键阶段,目前认为,炎症和氧化应激是引起NASH的最主要的原因[8].葛根素有抗炎和抗氧化的活性[9].有研究提示[10],葛根素可以减轻肝脏中脂质沉积以及改善肝功能并能改善小鼠NASH,但其具体机制并不清楚.本研究首次发现,葛根素对NASH的保护作用可能与其上调肝脏细胞核内Nrf2的表达有关.

在NASH进展过程中,炎症因子不仅促进肝脏的炎症反应,同时也能激活炎症细胞,诱导炎症反应和氧化应激的发生,从而进一步引起纤维化的发生[11,12].TNFα和IL-1β是NASH发生发展过程中重要的炎症介质,因为它们能够激活分泌促炎因子的库佛细胞[13].既往也有研究表明[5,14],葛根素能够改善肝脏的炎症.Zhou等报道[14],葛根素可以改善2型糖尿病大鼠血清和肝脏中的炎症,可以降低血清中的IL-18、IL-1β、TNFα的水平.在本实验中,模型组小鼠血清TNFα和IL-1β上升到了2倍以上,而肝脏中TNFα和IL-1β的mRNA表达水平也是升高的.葛根素能够明显下调血清中TNFα和IL-1β的水平和肝脏中这两者的mRNA水平,这说明葛根素在MCD诱导的NASH模型中具有抗炎作用.H&E染色也证实了这一点.模型组小鼠肝脏中炎性细胞集聚明显,而葛根素干预后其炎性细胞浸润明显减少(图2).除了改善炎症之外,葛根素还改善了小鼠肝脏的纤维化情况.本研究肝脏天狼猩红染色显示,MCD饮食能够引起肝脏纤维化,而加入葛根素后,肝脏纤维化明显改善.实时荧光定量PCR显示,葛根素能够明显下调纤维化基因的表达(图6).综上,本研究证明,葛根素可以改善肝脏损伤、改善肝脏炎症和纤维化.

氧化应激是NASH发生发展的重要因素[15].氧化应激促进脂质的沉积和脂质过氧化,激活库佛细胞和肝星状细胞从而引起炎症反应和肝纤维化[15,16].与模型组相比,葛根素可以显著上调肝脏中抗氧化因子GSH和SOD的活性,并且能够降低肝脏中脂质过氧化产物MDA的水平(图7).

Nrf2是抑制氧化应激反应的关键调节因子,在氧化应激时,游离的Nrf2易位到细胞核并结合到抗氧化酶反应元件上,促进多种抗氧化酶的转录,发挥抗氧化作用[6,7].Sharma等[17]发现,激活Nrf2可明显降低内质网应激反应,下调炎症基因的表达,改善肝脏纤维化,降低氧化应激标志物的表达,并进一步减轻NASH中的纤维化.既往研究表明[18,19],上调Nrf2能够明显改善饮食诱导的小鼠肝脏中的气球样变、脂肪变和炎症.上调小鼠肝脏Nrf2后,可预防NASH的纤维化进展[20].本实验饮食中加入葛根素后,小鼠肝脏组织细胞核内的Nrf2的表达明显上调,其靶基因HO-1在细胞浆中的表达也上调,说明葛根素对小鼠MCD饮食诱导的NASH的改善作用可能与上调Nrf2通路抑制肝细胞氧化应激有关.本研究首次发现,葛根素可能能够通过上调Nrf2改善MCD诱导的小鼠NASH.未来,需要Nrf2基因敲除小鼠实验来进一步证实这一点.

4 结论

葛根素对MCD诱导的小鼠NASH模型有保护作用,其主要通过减轻氧化应激,抑制炎症反应从而减少脂质沉积,减弱肝脏纤维化.葛根素抑制NASH的进展,减轻炎症和纤维化,可能与葛根素上调Nrf2通路抑制氧化应激相关.本研究为深入了解NASH的发病机制提供了新的思路,并为葛根素作为抗NASH的潜在药物提供了进一步的证据.

文章亮点

实验背景

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪性肝病向肝硬化和肝癌发展的关键阶段.目前仍然缺乏治疗NASH的有效药物.葛根素对NASH有改善作用,但其机制未明确.

实验动机

本研究试图探讨葛根素对小鼠NASH的改善作用及对细胞核内转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)信号通路的影响,旨在为开发的治疗药物提供思路.

实验目标

本研究旨在通过建立蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠NASH模型,观察葛根素对肝炎的改善作用以及对炎症和氧化应激的影响,并分析其对Nrf2信号通路相关蛋白的影响.

实验方法

本研究成功建立蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠NASH模型,并给予葛根素口服治疗,观察小鼠肝脏标本和炎症标本以检测肝脏组织病理损伤情况,血清转氨酶、肝脏脂质、肝脏炎症指标、肝脏氧化应激标志物的水平.

实验结果

给予葛根素治疗后,小鼠血清中的转氨酶下降,肝脏中甘油三酯含量和胆固醇含量降低,炎症和纤维化改善,抗氧化因子谷胱甘肽和超氧化物歧化酶活性显著升高,脂质过氧化标志物丙二醛是显著降低.

实验结论

葛根素能够改善NASH小鼠转氨酶水平、肝脏炎症、纤维化和氧化应激水平,其机制可能是通过调控Nrf2通路实现的.

展望前景

目前仅对动物实验进行研究,未来需要Nrf2基因敲除小鼠实验来进一步证实我们的结论,并为葛根素作为抗NASH的潜在药物提供进一步的证据.