基于基因测序的有氧运动介导CUMS抑郁小鼠作用机制研究

屈红林，刘瑞莲，陈嘉勤，陈 锐

高通量测序即二代测序，该技术可一次性对一个物种的转录组和基因组几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定，已经成为当前科学研究的重要手段[1]。目前使用最广、效果最好的是二代测序方法，即高通量测序技术。二代测序技术以极低的单碱基测序成本、超高的数据产出量，避免繁琐的克隆技术，具有较高的可靠性和准确性等特点[2]。二代测序技术在全基因重测序、表达谱分析、转录组测序、SNP 分析、DNA甲基化、mi-croRNA、MBD、Seq、ChIP-Seq等研究领域应用广泛。通过对比CUMS 抑郁造模小鼠与有氧运动干预抑郁小鼠血液和海马组织进行高通量测序，分析2 种组织中差异表达基因的异同，为临床血液检测提供借鉴。

1 研究对象与方法

1.1 实验动物与处理

实验选用健康雄性 C57BL/6 小鼠 42 只，8 周龄，SPF 级，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供（SCXK湘2016-0002）。标准B 级齿啃类动物干 燥 饲料 喂 养 ，维 持 饲 料 合 格 证 号 ：NO. 43200600003 951，许 可 证 号 SCXK（湘）2014-0002，自由饮食，分笼饲养，6 只/笼，室温（25±1）℃，湿度（50±10）%，自然昼夜节律光照。在实验室适应性喂养 1 周后，随机数字法分为空白对照组（CG）12 只、造模组（MG）15只、模型运动组（ME）15 只。

1.2 研究方法

1.2.1 CUMS抑郁小鼠造模及样本处理 对13 种应激刺激因子采用在线随机数字生成器方法，总造模时间28 天（4 周），按照随机数的数目为28，最小值为1，最大值为13，选择随机数的性质为随机，生成随机数[3]。同样方法生成2 次，将2 次配对组合，并适当调整重复和相邻重复的随机数字，最终确定刺激的具体方案。13 个应激因子分别为昼夜调整、光照性质、禁食、禁水、倾斜45℃鼠笼、潮湿垫料、4℃冰水游泳、45℃高温游泳、水平震荡、轻夹鼠尾、束缚、白噪音和间断（闪光）刺激。

所有小鼠禁食过夜，次日以 1% 戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，随机选取6 只进行开胸自心脏提取新鲜血液，迅速采取Trizol 法提取总RNA，-80℃冻存备用。处死后的小鼠于冰上剥离头部皮肤，暴露颅骨，眼科镊自枕骨大孔轻轻撬开颅骨，充分暴露脑组织，小心剥离大脑左右皮层后，暴露整个海马组织，玻璃分针剥离海马组织与大脑皮层及周围脑组织，取出海马，冰磷酸缓冲盐溶液（Phosphate buffer saline，PBS）液冲洗，滤纸吸掉多余水分，称重后于Trizol 试剂中-80℃冻存备用。在剩余小鼠中再随机选取6 只进行脑在体固定，冰上取脑后于4%多聚甲醛固定48 h 以上，石蜡包埋。

1.2.2 中等强度有氧跑台运动方案 模型运动组小鼠参考Bedford 训练方案进行改进，即在造模成功后按照10 m/min、0°坡度，由第1 天的10 min，每天递增10 min，共计6 天后，开始正式训练，以10 m/min，0°坡度，60 min/天，6 天/周，连续训练8 周。运动训练时间均安排在上午9:00-11:30 进行。训练期间无小鼠死亡。

1.2.3 造模与干预效果评定 （ 1）神经行为学评定。最后一次运动训练结束当天，每组随机数字法选取10只小鼠进行糖水偏好试验和强迫悬尾测定，用于评价小鼠快感缺失和绝望行为的程度。（2）小鼠海马组织Nissl 染色。石蜡包埋组织进行全自动切片机切片，厚度为5 μm，严格按照步骤进行海马组织Nissl染色，每只染色片在电镜下随机选取5 个视野观察拍照，观察细胞形态，用Image-Pro Plus6.0 软件分析尼氏体累积光密度值。

1.2.4 总RNA提取 （ 1）血液总RNA 提取。抗凝管自心脏提取新鲜血液后，轻轻颠倒8～10 次，按照1:1加入PBS 液稀释后，再取新的离心管按照稀释后的溶液1:1 加入白细胞分离液液面，低速离心20 min。离心后，待吸管小心吸出弃去分离液上层约0.5 cm上清液后，再小心吸取分离液层，即白细胞层，置于另一新离心管中，加入 2 mLPBS 洗涤液，混匀后室温 2 000 rpm 离心 10 min，弃上清，加入 1 mLPBS液，移入 EP 管，混匀、室温4 000 rpm 离心5 min，得沉淀。移液器去除上清液，留下完整管底白细胞团，涡旋或轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬，加入1 mLTrizol至沉淀中，吹打及震荡管壁，直至沉淀明显溶解。滴加200 μL 氯仿，震荡15 s，室温静置5 min，4℃12 000 rpm 离心15 min，吸取上层水相移入新的EP 管。加入预冷的异丙醇 0.5 mL 沉淀总 RNA，震荡混匀，室温或-20℃静置10 min（最好过夜）。4℃12 000 rpm 离心 15 min 后弃上清。滴加 75% 乙醇（DEPC 处理）1 mL 洗涤1～2 次。4℃ 12 000 rpm离心10 min 后，弃上清液保留沉淀物，倒置于干净的吸水纸上，空气自然干燥 10 min。加入20～40μL RNase-free 处理水溶解RNA。

（2）海马组织总RNA 提取。取出已加入Trizol 试剂的海马组织，于预先制冷的电动匀浆器冰上匀浆，充分裂解。室温静置10 min 后，滴加1/5 体积的氯仿，快速震荡15 s 后4 ℃12 000 g15 min 离心。将上清层移至新的EP 管滴加1/2 体积异丙醇，充分混匀静置5min 后4 ℃12 000 g15 min 离心，弃上清，再滴加1 mL75%乙醇，快速震荡15 s，4 ℃7 500 g5 min离心，弃上清。自然干燥RNA沉 淀 ，加入去RNase水溶解RNA，-80 ℃冻存备用。

（3）总RNA浓度/纯度测定。每样取2 μL，经紫外分光光度计测定OD值，计算OD260/OD280 的比值，比值位于1.8～2.0 之间，表明样品纯度较高，无其他杂质污染。电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量。

1.2.5 mRNA 测序文库建立与测序 所有测序样本从超低温冰箱取出后，为防止样本反复冻融，用装有5～10 kg 干冰的泡沫盒密封运送至北京诺禾致源科技股份有限公司，进行测序。用带有 Oligo（dT）的磁珠通过 A-T 互补配对、mRNA 的ploy A 尾结合的方式对检验合格的样品进行富集[4]。

1.2.6 差异基因筛选 按照有氧运动组和模型组基因差异倍数（Fold Change，FC）进行筛选，选择标准为log2（FC）≥1 或log2（FC）≤-1。

（1）GO（Gene Ontology）分析。GO 分为细胞组成（Cellular Component，CC）、生物过程（Biological Process，BP）和 分 子 功 能（MolecularFunction，MF）3 部分。按照超几何分布原理，计算挑选出的差异基因同GO 分类中某几个特定分支的超几何分布关系，通过假设验证得出特定P值，判断其是否在该GO 中富集[5]。

（2）KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge-nomes）分析。通过Pathway 将生物体内不同基因相互协调发挥其生物学功能进行显富集分析，可确定差异表达基因参与最主要信号转导或生化代谢途径。Pathway 应用超几何检验，以KEGG 数据库中Pathway 为单位，找出整个基因组差异表达基因中显著富集的Pathway[6]。

2 实验结果与分析

2.1 CUMS抑郁造模与运动干预效果

2.1.1 神经行为学评定 从检测结果看，造模后的MG小鼠比CG 组呈现十分显著性降低（P＜0.001），但随着运动的实施，ME 组小鼠糖水偏好指数有较大幅度回升，提示有氧跑台运动可使抑郁小鼠快感缺失的症状得以逆转。强迫悬尾不动时间检测结果也验证糖水偏好试验的检测结果。ME 组小鼠强迫悬尾不动时间比CG 组低，提示有氧运动能有效减轻抑郁小鼠的绝望行为，这在前期研究成果中也得以验证[7]。

2.1.2 Nissl染色 海马组织CA1 区神经细胞尼氏体染色结果显示，MG 组染色变浅，神经细胞总数减少，出现明显的尼氏体核固缩，严重的还呈现明显的空泡样病变，尼氏体累积光密度值明显降低（P＜0.05）。与MG 组相比，ME 组神经细胞核固缩现象减少，神经细胞数目增多，染色清晰，分布趋于均匀，尼氏体累积光密度值明显增加（P＜0.05），提示有氧运动能有效减轻抑郁小鼠的绝望行为，呈现较好的细胞修复现象。

2.2 高通量测序结果的处理与分析

2.2.1 Total RNA的检测结果 经 1% 琼脂糖凝胶电泳纯度检测[8]，显示所有样本均包括28S、18S 和5S条带，其中28S 和18S 条带清晰，28S 条带的亮度较18S 条带明显，提示 TotalRNA 完整性较好，可用于后续的实验研究。

2.2.2 转录组测序数据质量结果 6 个样本的测序结果通过过滤后分别得到 8.28G、8.04G、8.11G、9.15G、9.83G 和7.38G 高 质 量 序 列（Clean reads），且测序错误率 均 低 于 0.03%，碱 基 质 量 值Q20 ≥96.97%，Q30 ≥92.28%，完全符合预定测序要求，均可用于进一步分析（见表1）。

表1 各组小鼠血液与海马组织测序结果汇总Table 1 Summary of Sequencing Results of Blood and Hippocampus of Mice in Each Group

2.2.3 测序错误率分布检测结果 由测序Phred 数值通过公式（Qphred=-10log 10（ e））转化获取每个碱基测序错误率。结果显示，Phred 数值通过概率模型计算碱基识别（Base Calling）过程中获取的单碱基错误率分布结果符合样品测序要求。

2.2.4 A/T/G/C含量分布检测结果 检查结果显示，Illu-mina 测序中，反转录成cDNA 时6bp 的随机引物会引起前几个位置核苷酸组成出现一定偏好性，影响转录组测序的均一程度[9]。理论上，普通文库中A 和T 碱基及G 和C 碱基含量在每个测序循环上应分别对等，整个测序过程基本稳定不变，但对于链特异性建库则会出现GC分离现象[10]。本实验样本检查结果显示，因随机引物扩增偏差导致Illumina测序的每个read前6~7 个碱基出现较大波动，但不影响后续定量分析。

2.2.5 差异表达基因筛选 为探究不同组别的不同样本转录组间的差异，针对不同组别小鼠血液与海马组织间的差异表达基因筛选阈值按照P＜0.05，|log2（Fold Change）|＞1 为 标 准 进 行 筛 选。结 果显示，在模型运动组与模型组血液间共鉴定出693个差异表达基因，在上调的166 个基因中新基因有7 个，下调的527 个中新基因12 个。ENSMUSG00000000204（Slfn4，Schlafen family||Schlafen，AAA domain）上调基因中上调倍数最高，位于11 号染色体上，其表达相应干扰素α，并在Toll 样受体激动剂激活期间被诱导，主要与炎症反应相关。在下调基因中，下调倍数最高的是ENSMUSG00000049775（Tmsb4x thy-mosin，beta 4，Xchromosome），位于 X 染色体上，与细胞迁移直接相关。模型运动组与模型组海马组织间共鉴定390个差异表达基因，上调基因266 个（含新基因1 个），下调基因 124 个（含新基因 1 个）。在上调基因中，ENS-MUSG00000027447（Cst3，Cystatin C）上调倍数最高，位于2 号染色体上，其基因编码的蛋白质是参与神经变性和心血管过程的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可抑制β-淀粉样蛋白的聚集。在下调基因中，下调倍数最高的是ENSMUSG00000092341（Malat1，metastasis asso-ciated lung adenocarcinoma transcript 1（non-codingRNA）），位 于19 号染色体上，其基因产生长的非编码RNA，被切割成成熟的功能性转录物以及小的细胞质RNA（mascRNA），成熟的转录物通过 3’结构稳定并保留与细胞核内，可调控基因的表达与增殖。为评估各差异表达基因在不同组别小鼠血液与海马组织中的整体分布，以-log10（p-value）为纵坐标、log2（foldchange）为横坐标构建差异表达基因火山图（见图1）。

图1 各组小鼠学血液与海马组织差异基因火山图Figure 1 Volcanic Maps of Differential Genes in Blood and Hippo-campus of Mice in Each Group

考虑到表达模式类似的基因可能共同参与同一代谢过程、细胞通路或具有相似功能[11]，测序通过将相同或相近表达模式的基因聚集成类，推测已知基因新功能与未知基因功能。本实验测序结果显示，在不同的处理条件下同一cluster 中的基因具有相似的表达水平和变化趋势。

2.2.6 差异表达基因的GO分析 （ 1）血液组织差异表达基因的GO 分析。为更好地探究差异表达基因涉及的生物学过程，采用GOseq 方法对差异表达基因进行GO 富集分析。通过富集分析，以ME vs MG 组血液组织中的差异表达基因为例，所有差异表达基因中共有634 个基因被富集到7 548 条GO terms 中，其中5 733 条富集到生物过程，716 条富集到细胞组成，1 099 条富集到分子功能。按照富集分析统计学显著水平，P＜0.05 进一步进行显著性分析，结果显著性差异表达基因被富集到2 272 个GO terms中，占所有terms 的30.10%，其中1 705 条富集到生物过程，287条富集到细胞组成，280 条富集到分子功能。在显著差异表达富集到相应条目的基因中，有484 个下调基因，富集于2 094 条GO terms 中，150 个上调基因富集于179 条GO terms 中。其中，下调基因中 1 562 条富集到 BP 中，281 条富集到CC 中，250 条富集到MF中；上调基因中143 条富集到BF 中，6 条富集到CC中，30 条富集到MF 中。

（2）海马组织差异表达基因的GO 分析。富集分析结果显示（以MEvsMG 为例），所有差异表达基因中共有333 个基因被富集到977 条GO terms 中，其中639 条富集到 BP 中，197 条富集到 CC 中，141 条富集到MF 中。按照富集分析统计学显著水平，P＜0.05进一步进行显著性分析，结果显示显著性差异表达基因被富集到403 个GO terms 中，在显著差异表达富集到相应条目中的基因，有115 个基因下调，显著富集于21 条 GO terms 中，218 个基因上调，显著富集于 283 条GO terms 中。其中，在下调基因中7 条富集于BP，12 条富集于CC，2 条富集于MF；上调基因中154 条富集于BP，90 条富集于CC，39 条富集于MF。

（3）小鼠血液与海马组织GO 显著富集结果对比分析。对比 2 种组织的 GO terms 发现，在分子功能中，血液与海马组织的7 个基因涉及β-淀粉样蛋白沉淀（GO：0001540，beta-amyloid binding），分 别 是Itm2b、Atp1a3、Cst3、Apoe、Scarb1 和Msr1 等，这些基因多与机体神经系统病变、血管病变等相关。在生物 过 程 中 ，涉 及 到 运 动 调 控 的 GO terms（GO：0040012，regulation of locomotion）中 包 括10 个 上调基因 与 42 个 下 调 基 因 。 下 调 基 因 分 别是 Ccr7、DUSP10、Ddx58、IL-1β、Mcam、Sdc4 和S1pr1[12-16]，大多是参与机体免疫调节与信号转导通路等[17]。上调基因分别是Ccr2、Ceacam1、Apoe、Angpt1、Lgals3、Gsn、Rtn4 和Nfkbid[18-24]等，大多参与神经系统的炎症性疾病[25]，并与运动关系密切。

2.2.7 差异表达基因KEGG分析 （ 1）小鼠血液差异表达基因KEGG 富集分析结果。对各组小鼠血液和海马组织的所有差异表达基因进行KEGG 通路分析，结果显示（以ME vs MG 为例），共计199 个基因富集到14 个KEGG 通路上，其中，26 个基因富集到血小板活化，29 个基因富集到吞噬，24 个基因富集到帕金森病的发病机制，26 个基因富集到阿尔茨海默病发病机制，22 个基因富集到氧化磷酸化过程，16 个基因富集到ECM-受体相互作用，15 个基因富集到造血细胞谱系，14 个基因富集到心肌收缩，4 个基因富集到长期抑郁病理改变，6 个基因富集到NF-kB 信号通路，6个基因富集到Toll 样受体信号通路，6 个基因富集到TRP 通道的炎症介质调节，3 个基因富集到TGF-β信号通路，2 个基因富集到 PPAR 信号通路。其他KEGG 富集通路还包括5-羟色胺能突触、胆碱能突触、多巴胺能突触和雌激素等富集通路的差异基因表达，虽不具统计学意义，但基因表达的富集通路也具有一定意义。

（2）小鼠海马组织差异表达基因KEGG 富集分析结果。海马组织中共有 340 个基因富集于 16 个KEGG通路，其中82 个基因富集到核糖体，44 个基因富集到氧化磷酸化，41 个基因富集到帕金森病的发病机制，42 个基因富集到阿尔茨海默病的发病机制，58 个基因富集到代谢途径，3 个基因富集到PPAR 信号通路，6 个基因富集到cAMP 信号通路，3 个基因富集到雌激素信号通路，5 个基因富集到过氧化物酶体，6 个基因富集到吞噬，4 个基因富集到谷氨酸能突触，2 个基因富集到胆碱能突触，1 个基因富集到5-羟色胺能突触，1 个基因富集到多巴胺能突触，1 个基因富集到TRP 通道的炎性反应调节。其他富集的KEGG通路还包括Wnt 信号通路、ECM-受体相互作用、趋化因子信号通路、MAPK 信号通路和PI3K-Akt 信号通路等，虽然未达到P＜0.05 的显著性统计学意义，但信号通路相关基因差异表达显著。

（3）小鼠血液与海马组织KEGG 显著富集结果对比分析。对比2 种组织KEGG 通路分析显示，在氧化磷酸化、帕金森病和阿尔茨海默病的发病过程、吞噬、多巴胺能突触、TRP 通道的炎性反应调节等关联性较强。对比其差异表达基因有所区别。对比分析结果显示，KEGG 显著富集的通路与神经元退行性病变、炎症等有关。

3 结 论

高通量测序技术及其生物信息学发展为临床疾病和动植物病变的诊断与康复治疗产生深远影响。在肯定测序技术优势的同时，在人与动物急慢性疾病的研究仍不够成熟，尤其是在靶向调控关系的预测和实验验证方面存在诸多挑战。本实验采用CUMS抑郁造模成效显著，运动干预后的康复效果突出。实验测序样本错误率、碱基含量、差异表达基因筛选结果可靠，预测分析其靶基因位点，KEGG和GO分析结果验证了显著富集的差异表达基因主要与长期抑郁、抑郁炎症、细胞凋亡与自噬及其相关信号通路关系密切，确定炎症、凋亡与自噬诱发小鼠抑郁的病理机制，证实了血液与海马组织高通量测序结果显著富集的高度一致性，为临床采用血液检测结果反应海马组织疾病及其干预效果提供借鉴。同时，由于实验研究测序选择的实验组别仅限于空白鼠、模型鼠和运动干预鼠，且实验设计方法并未采取基因干扰或基因敲减等技术，因此，缺乏具体信号通路诱导作用机制的深入探讨，但为后续实验研究拓宽了思路，奠定良好的实验基础。