‘潢川金桂’花瓣衰老过程中细胞程序性死亡的生理机制

贺 贝，蔡 璇，曾祥玲，王彩云，周 媛，邹晶晶

（1.湖北科技学院 国家林业草原桂花工程技术研究中心，湖北 咸宁 437100；2.华中农业大学 园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北 武汉 430070；3.武汉市农业科学院 林业果树研究所，湖北 武汉 430070）

桂花Osmanthusfragrans为木犀科Oleaceae 园林观赏植物，是中国十大传统名花之一，自古享有“独占三秋压众芳”的美誉。其树姿优美，在园林中常用作行道树、孤植树；因香气浓郁，被列为中国重要的天然保健植物和特产经济香花植物，广泛用于食品添加剂及护肤品等产业。关于桂花茶、桂花(米)酒、桂花糕等鲜花采收加工产业已成熟，近年来新兴的桂花香水、乳液、香熏和精油等高档化妆品也逐渐打开市场[1-3]。然而，由于桂花花期较短，最佳观赏期和采收期仅2～3 d，极大地限制了其观赏价值与经济价值[4-5]。在目前记载的160 多个桂花品种中，大部分由于雌蕊败育不结实，表现为开花后期脱落型；另一类为结实型桂花品种，开花后期花瓣表现为萎蔫，在树体不脱落[6]。前期研究发现：在不结实桂花品种‘柳叶金桂’O.fragrans‘Liuye Jingui’的衰老过程中，当脱落期花瓣出现明显可见的衰老特征时，花瓣中DNA 断裂迅速增加，衰老后期花瓣中出现染色质凝结等典型的细胞程序性死亡(PCD)现象[4,7]。然而，对于结实型桂花衰老过程中的PCD 特征还不清楚。因此，本研究以结实型桂花品种‘潢川金桂’O.fragrans‘Huangchuan Jingui’为试材，探索结实型桂花花瓣衰老过程中PCD 特征，为桂花花瓣衰老机制提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

选取华中农业大学校园内40～50年生、健康、无病虫害、四周光照均匀的‘潢川金桂’植株，分别采收不同开花阶段的桂花花朵，收集花瓣后称量，保存在冰盒或者液氮中，立即带回实验室，进行指标的检测并存至-80 ℃超低温冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 开花级数的划分 参考ZOU 等[4]桂花开花级数的划分体系，将 ‘潢川金桂’开花级数划分为：①铃梗期(花苞期)，花朵呈紧闭的花苞状，未展开；②初花期，花朵微张，呈半开放状态；③盛花期，花瓣完全展开，柱头产生黄色黏性物时进行授粉，花径达到最大；④盛花末期，花瓣略微开始失水，有的花瓣伴随褐斑出现；⑤萎蔫期，花朵失水萎焉并留在树体上，花瓣呈黄褐色，子房略膨大。

1.2.2 超氧阴离子(ROS) 和过氧化氢测定 参考ZOU 等[4]的方法测定ROS 质量摩尔浓度(nmol·g-1)，参考林植芳等[8]的方法测定过氧化氢质量摩尔浓度(nmol·g-1)。称取新鲜花瓣组织0.2 g，按材料与提取液1∶1 的质量比加入4 ℃下预冷丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管10 000 r·min-1离心10 min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。用Ti2(SO4)-浓氨水法制作过氧化氢标准曲线，取样品提取液1 mL 用于反应测定。

1.2.3 细胞色素c 和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)测定 参考ZOU 等[5]的方法，以小鼠细胞色素c 单克隆抗体(Merck & Co.,Inc)作为一抗(1∶200 稀释)，用封闭液按1∶50 000 稀释相应的HRP 标记羊抗小鼠二抗。参照ZOU 等[5]的方法，采用高效液相色谱法检测ATP 质量分数(ng·g-1)。

1.2.4 乙烯释放量测定 参考ZOU 等[4]的方法测定桂花乙烯释放量(nL·g-1)。

1.2.5 DNA 相对含量测定 参考YAMADA 等[9]的方法，采用流式细胞法测定不同衰老时期桂花花瓣中核含量(DNA 团块)的变化。将桂花花瓣置于细胞核提取缓冲液中，将提取物通过50 μm 尼龙网过滤，收集分离介质和DNA 凝聚物，DAPI 染色后，将溶液旋涡混合，用流式细胞仪分析从细胞核中分离出的DNA，计算并分析5 000 个样品细胞中所含有核的DNA 相对含量。流式细胞仪的仪器型号为BECKMAN COULTER (Cell Lab QuantaTM)，仪器条件为：Ev 2.36；FL1 5.12、5.9；SS 5.12；5 000 个细胞。

1.2.6 数据统计分析 每处理3 次生物学重复，数据为平均值±标准误。用SAS v.8.0.软件进行方差分析和多重比较分析(Duncan,P=0.05)。

2 结果与分析

2.1 超氧阴离子和过氧化氢质量摩尔浓度的变化

在‘潢川金桂’桂花开花至衰老过程中，超氧阴离子质量摩尔浓度在初花期显著上升到最大值，为344.6 nmol·g-1，其后逐渐降低至200 nmol·g-1(图1A)。在‘潢川金桂’初花期花朵刚开放时，过氧化氢的质量摩尔浓度也显著地迅速上升到最大值，为437 nmol·g-1，此时过氧化氢质量摩尔浓度是花苞期的3 倍。在随后衰老过程中，过氧化氢又下降到花苞期的水平(图1B)。

图1 ‘潢川金桂’开放及衰老过程中超氧阴离子(A)和过氧化氢(B)质量摩尔浓度的变化Figure 1 Changes in content of free radicals (O2· -,A) and hydrogen peroxide (H2O2,B) in petals of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

2.2 细胞色素c 的释放

如图2所示：从线粒体释放细胞质中的细胞色素c 在初花和盛花期变得明显，表明此时已经发生了线粒体细胞色素c 的泄漏；在盛花末期开始逐渐减弱，在萎蔫期的花瓣中则逐渐消失，可能与此时花瓣衰老细胞膜功能逐渐丧失有关。

图2 ‘潢川金桂’开放及衰老过程中细胞色素c 的释放Figure 2 Release of cytochrome c during the petals senescence of O.fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

2.3 ATP 质量分数的变化

如图3所示：在‘潢川金桂’的铃梗期花瓣中测量到较高的ATP 水平(63.9 ng·g-1)，但随着花朵的开放至萎蔫期时，‘潢川金桂’花瓣中的ATP 质量分数为31.8 ng·g-1，只有花苞期的一半。由此可见，在桂花花瓣衰老过程中ATP 消耗或缺乏可能是PCD 发生的早期信号。

图3 ‘潢川金桂’开放及衰老过程中ATP 质量分数的变化Figure 3 ATP content in petals of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

2.4 乙烯释放量的变化

在‘潢川金桂’开放及衰老过程中，乙烯释放量从盛花期开始逐渐上升；盛花末期花瓣出现可见的外观衰老特征时，其释放量显著增加到35.9 nL·g-1·h-1，而在萎蔫期时上升至最大值，为91.2 nL·g-1·h-1(图4)，因此乙烯释放类型表现为典型的末期上升型，其释放量的增加可能与花瓣晚期PCD 事件的发生相关。

图4 ‘潢川金桂’开放及衰老过程中乙烯释放Figure 4 Ethylene production in petals of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

2.5 核DNA 相对含量的变化

如图5所示：DNA 相对含量在开花早期相对稳定，而随着花瓣衰老进程的发展，核DNA 相对含量逐渐降解，直到萎蔫期花瓣的核DNA 基本消失，暗示着核DNA 完全降解。

图5 ‘潢川金桂’开放及衰老过程中核DNA 相对含量的变化Figure 5 DNA content the petals senescence of O. fragrans ‘Huangchuan Jingui’ at each developmental stage

3 讨论

花瓣衰老标志着花朵生命的最后阶段，是发育相关的PCD[9]。PCD 的诱发和执行过程都常常伴随一系列典型的生理、生化、形态学上的变化以及特征事件[10-11]。在动物细胞PCD 进程中，ROS 可以作为信号分子激活线粒体上非特异性的通透性孔道(PTP)开放[11-17]，从而造成线粒体中细胞色素c 和凋亡诱导因子(AIF) 释放到细胞质中，而后细胞色素c 与凋亡酶激活因子(Apaf-1) 结合，从而促使细胞发生PCD[10]。在本研究中,‘潢川金桂’活性氧含量在初花期急剧增加，可能是桂花花瓣PCD 早期诱导因子。作为线粒体中电子传递链的重要组成成分，细胞色素c 泄露会导致电子传递链受阻，线粒体功能活性下降，从而导致ATP 减少[18]，最终加快花瓣衰老。在‘潢川金桂’花瓣衰老过程中，细胞质中细胞色素c 逐渐积累，至盛花期达到最大，ATP 水平从初花期开始持续下降，说明此时线粒体功能活性已逐渐丧失。在郁金香花瓣中，能量损耗也被认为是诱发细胞程序性死亡的早期信号[15]。

有些不结实的桂花栽培品种，盛花后2～3 d，在花瓣仍然具有膨压时便脱落[5-6]；而在大多结实的桂花栽培种中，通常以花瓣萎蔫为衰老特征。乙烯是一种促进成熟与衰老的激素，也是导致花瓣发生细胞程序性死亡的因素之一，在促进DNA 片段化、导致花瓣脱落和枯萎等方面发挥着作用[12]。研究表明：大多数植物的花瓣脱落都对乙烯敏感，且受到内源乙烯的调控[19-20]。在‘柳叶金桂’衰老过程中，乙烯的增加导致花瓣细胞中液泡结构损坏，在外观上表现为花瓣褐化和失水萎蔫[4]。也有研究发现：花瓣明显可见的萎蔫常常伴随着乙烯峰骤变，该乙烯骤变多又与授粉结实有关[21-23]。在本研究中，当结实型桂花品种‘潢川金桂’萎蔫期花瓣内乙烯释放量增加到最大值时，对应的外观形态上表现出枯萎、褐化，细胞内部发生核DNA 的降解等现象，说明乙烯可能是导致结实型桂花花瓣衰老的主要执行因子。在月季Rosa×hybrida花瓣程序性死亡的研究中发现：施用外源乙烯可以诱导ACC基因的表达，促进内源乙烯的生物合成，从而加速PCD 进程[24]。

DNA 断裂和降解作为PCD 发生的标志性特征之一[25]，常表现出经典的“DNA ladders”，如唐菖蒲Gladiolus、六出花Alstroemeria和飞燕草Delphiniumbelladonna[9,26-27]；而有些植物衰老过程中并没有出现“DNA ladders”，如矮牵牛Petunia[28-29]。在‘柳叶金桂’的花瓣衰老过程中也未检测到“DNA ladders”，但通过原位末端标记法(TUNEL)发现：其花瓣在盛花末期开始发生明显的DNA 断裂和降解；且其DNA 降解受内源乙烯调控[4,7]。在本研究中，花瓣衰老后期乙烯的骤变与后期DNA 相对含量的下降，说明乙烯可能促进了“潢川金桂”花瓣DNA 的降解，在矮牵牛[30]和豌豆Pisumsativum[31]中也有类似报道。

4 结论

本研究探索了结实桂花品种‘潢川金桂’衰老的PCD 特征，表明ROS 激发、细胞色素c 释放和ATP 质量分数下降是早期PCD 诱导因子；乙烯跃变可能作为晚期作用因子促进花瓣细胞的失水、萎蔫和DNA 降解。