分光光度法测定酱油种曲的孢子数

李兴周，刘建华，李远珍，黄佳玲

（广东厨邦食品有限公司，广东阳江 529500）

酱油酿造主要包括酱油种曲培养、大曲培养、晒场发酵三大过程，其酿造的第一步是生产优良的种曲，即米曲霉的扩大培养物，它要求孢子健壮、数量多[1]。种曲孢子数是衡量种曲质量的一个重要指标，要求孢子数大于90亿个/g干基[2]。目前，酱油种曲孢子数的检测方法主要参照《孢子数测定法》（SB/T 10315——1999），即血球计数法。在计测孢子数的实际操作中，需先对样品进行稀释、再取其稀释液制片、而后镜检计数，其中制片后往往需静置2～3 min使孢子沉降再镜检计数，单个样品镜检计数时间约10～15 min，且需镜检计数2次以上，再取其平均值作为检测结果，因此单个样品制片与镜检计数约需30 min，该检测方法费时费力且2次镜检计数结果偏差较大。

有少量文献报道采用光电比浊法测定顶头孢霉菌、黑曲霉、白地霉和康宁木霉孢子数，该方法具有简单、快速、准确的特点[3-4]。本实验尝试采用分光光度法对酱油种曲的孢子数进行测定，且与上述血球计数法进行对比分析，以达到用分光光度法替代血球计数法，为酱油种曲孢子的计数提供一种简单、快速、准确的测定方法。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

酱油种曲（米曲霉），由广东厨邦食品有限公司提供。

乙醇（95%），分析纯，广东广试试剂科技有限公司；稀硫酸，自配，浓硫酸与水按体积比1∶9混合均匀即可。

1.2 仪器与设备

IKA RH磁力搅拌器，广州绿百草科学仪器有限公司；25×16血球计数板，上海求精生化试剂仪器有限公司；E100显微镜，南京江南永新光学有限公司；T6新锐可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9140A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准样液的制备

（1）称样。称取成熟酱油种曲（黄绿色、孢子多）（1±0.001） g，置于250 mL三角瓶内。

（2）孢子分散。向三角瓶内加入10 mL 95%乙醇、20 mL纯水及10 mL稀硫酸，再加入一小勺的玻璃珠和1颗搅拌子，置于磁力搅拌器电磁板上搅拌，以1 000 r·min-1的转速搅拌30 min，使孢子个个分散。

（3）过滤定容。将分散后的样品使用100目纱布过滤至500 mL容量瓶中，采用纯水冲洗曲渣，务使滤渣不含孢子，再定容，倒置摇匀获得标准样液（每次使用/计数前需先将容量瓶上下颠倒10次摇匀）。

（4）标准样液计数。使用1 mL刻度吸管吸取1 mL标准样液，用滤纸擦干吸管外表面的余液，使标准样液从吸管中匀速滴出，取中间2滴于血球计数板的两个计数室上，再将盖片轻轻由一边向另一边压下，使盖片与计数板完全密合、液中无气泡，静置3 min，待孢子自然沉降后使用显微镜镜检计数，最后计算结果。做3次重复标准样液计数，取平均值作为标准样液对应酱油种曲的湿基孢子数[5]。

1.3.2 标准曲线的绘制

用移液管分别移取标准样液10 mL、20 mL、30 mL、40 mL和50 mL于50 mL容量瓶中，用纯水稀释至刻度，摇匀，以95%乙醇∶稀硫酸∶纯水=1∶1∶48的混合液为参比，在480 nm处用可见分光光度计测定其吸光度（每次测定前需将容量瓶中溶液上下颠倒10次摇匀，每个稀释度检测3次取平均值），以酱油种曲的湿基孢子数为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 酱油种曲干基孢子数的测定

（1）称样。同1.3.1称样中的操作。

（2）孢子分散。同1.3.1孢子分散中的操作。

（3）过滤定容。将分散后的样品使用100目纱布过滤至1 000 mL容量瓶中，采用纯水冲洗曲渣，务使滤渣不含孢子，再定容，倒置摇匀，即得样品测试液（每次测定前需先将容量瓶上下颠倒10次摇匀）。

（4）样品测定。取适量的样品测试液至比色皿中，参照“1.3.2”项下方法在480 nm处测定吸光度，计算测定结果。

（5）酱油种曲干基孢子数的计算。计算公式为

其中，酱油种曲水分含量的检测参照《食品安全国家标准 食品中水分的测定》（GB 5009.3——2016）[6]。

1.3.4 精密度实验

取适量1.3.3方法中的样品测试液至比色皿中，在波长480 nm处测定吸光度，连续测定6次，计算结果。

1.3.5 重复性实验

取同批次酱油种曲样品，按照1.3.3（1）～（3）中的操作方法平行制备5份样品测试液，参照“1.3.2”项下方法在480 nm处测定吸光度，计算测定结果。

1.3.6 方法对比

随机选取酱油种曲1#、酱油种曲2#、酱油种曲3#、酱油种曲4#、酱油种曲5#和酱油种曲6#共6批次成熟种曲作为实验样品，由2名操作熟练的检测人员各对3批次样品分别采用本法与血球计数法（参照1.3.1项下操作方法）进行孢子数测定，每个样品测定/计数2次，计算其干基孢子数，对比同一方法2次测定结果与同一样品两种方法的测定结果，从而分析确定分光光度法能否替代血球计数法测定酱油种曲的孢子数。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察结果

按照1.3.2的方法进行考察，以酱油种曲的湿基孢子数为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线，曲线回归方程为y=93.70x-1.53，线性相关系数R2=0.998 8，其拟合程度高。由图1可知，该方法测定酱油种曲的湿基孢子数在14～72亿个/g线性关系良好。

图1 湿基孢子数与吸光度的关系

2.2 精密度考察结果

按照1.3.4方法进行精密度考察，测定6次吸光度分别为0.353、0.348、0.359、0.351、0.345和0.356，平均吸光度为0.352，6次测定的相对标准偏差RSD为1.62%，表明该方法测定结果的精密度良好。

2.3 重复性考察结果

按照1.3.5方法进行重复性考察，该同批次酱油种曲样品的干基孢子数分别为122.75亿个/g、118.89亿个/g、120.67亿个/g、118.29亿个/g、116.80亿个/g，平均干基孢子数为119.48亿个/g，相对标准偏差RSD为1.92%。结果表明，本实验方法的测定结果重复性高、方法稳定（表1）。

表1 重复性实验结果

2.4 方法对比结果

不同分析方法间测定结果的比较，用于判断两方法间一致性，是检测实验室经常遇到的实际问题。新方法与经典方法间的比较，特别是在缺少标准样品，不满足t值检验的数据条件下，选用合适判据尤其重要。可考虑采用每组样品分别用两种方法测量一次，取两方法测定结果相对偏差，与实验室间相关偏差限值进行比较，用合格率大小判断两方法结果一致性程度[7]。本实验分别采用血球计数法与本法对酱油种曲1～6#的干基孢子数进行测定，计算同一方法2次测定结果与同一样品两种方法测定结果的相对偏差，结合酱油种曲干基孢子数测定结果相对偏差≤15%的控制要求计算相对偏差合格率，其结果如表2所示。

表2 方法对比实验结果

由表2可知，采用血球计数法测定酱油种曲干基孢子数，同一实验样品2次测定结果的相对偏差在1.51%～12.31%，平均相对偏差为7.06%，相对偏差合格率100%；采用分光光度法测定酱油种曲干基孢子数，同一实验样品2次测定结果的相对偏差在0%～4.02%，平均相对偏差为1.41%，相对偏差合格率100%，本法的相对偏差整体明显低于血球计数法，相比更加稳定、准确。同时，以两种方法2次测定结果的均值作为各自测定结果，考察两种方法间测定结果的一致性，其方法间的相对偏差在2.29%～11.27%，方法间平均相对偏差为6.32%，方法间相对偏差合格率100%。结果表明，两种方法测定结果的相对偏差符合酱油种曲孢子数检测控制要求，分光光度法能够替代血球计数法用于测定酱油种曲的孢子数。

3 结论

目前，对酱油种曲孢子数测定的研究较少，一般均采用血球计数法，本实验对比了血球计数法与分光光度法测定酱油种曲的孢子数，从实验可发现，血球计数法与分光光度法测定酱油种曲的孢子数均符合酱油种曲孢子数检测控制及方法学的要求。通过本实验研究表明，在14～72亿个/g酱油种曲湿基孢子数与吸光度线性关系良好，以标准曲线法测定时，精密度实验RSD为1.62%，重复性实验RSD为1.92%，与血球计数法的相对偏差合格率为100%，该方法可靠、准确稳定。同时，本实验采用分光光度法，直接使用处理好的孢子液测定吸光度即可，替代了血球计数法的制片与镜检计数操作，单个样品计数环节的检测时间可控制在1 min以内完成，检测效率较原方法提高了96.7%。由此可见，分光光度法可替代血球计数法，在生产中为酱油种曲孢子的计数提供一种简单、快速、准确的方法，具有广泛应用的价值，可为其他真菌孢子的计数研究提供参考。

当然，本实验还有一些不足的地方，本实验针对两种方法测定结果的一致性判断对比方法、样本量等还有完善空间，未考察不同培养工艺、不同出发菌株所得酱油种曲线性关系是否一致等，出发菌株、培养时间等不同均可能会对本方法产生一定影响，这些问题仍需在今后实验技术中不断研究改进。