大孔树脂分离纯化紫苏叶总黄酮的工艺研究

周 泉，唐 恺，张 偶，姚雅薇，杨怡玲，刘 最,2*

（1.衡阳师范学院南岳学院 生命科学系，湖南衡阳 421008；2.衡阳师范学院 生命科学学院，南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室，湖南衡阳 421008）

紫苏（Perilla frutescensL.）属于唇形科植物，我国很多地方都有分布，栽培历史久远[1]。紫苏在食品、医药、保健品等方面均有广泛应用。紫苏的三大器官如种子、叶、茎均可被食用，具有化痰、解表散寒、解毒、利尿和安胎等功效[2]。紫苏不仅富含多种营养成分，还含有多种生物活性物质，如黄酮类、酚酸类、萜类等。实验证明这些物质具有多种生物活性，如抗氧化、降血糖、抗菌、抗炎等[3-5]，而这些药理功效可能主要来自紫苏叶中的黄酮类成分，但目前涉及紫苏叶黄酮的分离纯化研究较少。大孔树脂分离纯化工艺具有易操作、选择性强、污染低、稳定性高等多种优点，已被广泛应用于中草药植物有效成分的分离纯化研究中[6-7]。例如，聂超等[8]用AB-8型树脂纯化伦晚脐橙总黄酮，纯度从3.61%提高到33.45%；刘刚等[9]用D101型树脂纯化伦晚脐橙总黄酮，纯度从33.72%提高至63.74%。本研究选取紫苏叶为实验原料，通过静态吸附和解吸实验，对总黄酮的分离纯化条件进行优化，以期获得纯度较高的黄酮类化合物，为后续研究该成分的药理作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原材料：紫苏叶购自广东省揭阳市。大孔树脂D101、HPD-100、HPD-600、AB-8和ADS-7（北京瑞达恒辉科技有限公司）；芸香叶苷（上海蓝季生物有限公司）；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

DHG-9040A电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；UV- 2550型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；H2050R高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；SB25-12DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 黄酮粗提物的制备

称取紫苏叶粉末10 g，加入70%的乙醇200 mL，于60 ℃水浴回流提取3次，每次70 min，合并滤液，超声30 min，旋转蒸发仪浓缩，备用。

1.3.2 黄酮含量的测定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法进行测定，前期准备得方程A=7.199X-0.0047（R2=0.9996），表现出良好的线性关系。

1.3.3 树脂的预处理

称取一定量的5种不同型号的大孔树脂，将其放入装有95%乙醇的锥形瓶中，浸泡过夜，用蒸馏水冲洗几次，直至无醇味；然后分别用3% HCl和3%NaOH溶液浸泡，最后用去离子水洗至中性，备用。

1.3.4 静态吸附和解析实验

分别称取2 g已处理好的5种不同型号的大孔树脂，装至具塞锥形瓶中，往瓶中分别加入3 mg·mL-1的样品液30 mL，置于25 ℃摇床，以150 r·min-1吸附24 h。取滤液测定，按公式计算吸附率。加入70%乙醇50 mL对树脂进行洗脱，解吸24 h，取滤液测定，按公式计算解吸率。

式中：C0为吸附前黄酮质量浓度，mg·mL-1；C1为吸附后黄酮质量浓度，mg·mL-1；C2为解吸后黄酮质量浓度，mg·mL-1；V1为样品液体积，L；V2为解吸液体积，L；M为大孔树脂干质量，g。

1.3.5 紫苏叶黄酮纯化工艺验证

称取3份3 g预处理好的D101型大孔树脂，加入浓度为3 mg·mL-1，pH为4的样品溶液30 mL，静态吸附5 h后；使用50 mL 70%乙醇对吸附饱和的树脂进行洗脱，解吸4 h后，收集洗脱液。将洗脱液60 ℃条件下浓缩，真空冷冻干燥，得到精制品。称取一定量的精制品，溶解于一定体积70%乙醇中，测定黄酮质量浓度Y，计算黄酮纯度为

式中：M为称取的精制品质量，g；V为溶解精制品的蒸馏水体积，mL；Y为精制品的黄酮质量浓度，g·mL-1。

2 结果与分析

2.1 最佳大孔树脂的筛选

树脂的极性和空间结构会影响其吸附效果。本实验选取5种不同的大孔树脂进行实验，从图1可知，5种树脂对紫苏叶中的黄酮均有一定的吸附效果，其中D101树脂的吸附能力较强，吸附率为79.49%，解吸率为81.84%。说明总黄酮中含有较多的非极性和弱极性化合物，这些化合物的极性与D101极为相近，因而吸附效果最好。综合考虑，本实验选取D101型大孔树脂作为紫苏叶总黄酮分离纯化的最佳树脂。

图1 大孔树脂静态吸附和解吸效果

2.2 大孔树脂对紫苏黄酮静态吸附和解吸动力学曲线

2.2.1 静态吸附动力学曲线

从图2可得，延长吸附时间，大孔树脂对总黄酮的吸附率逐渐升高，吸附时间达到5 h时，树脂表面对黄酮的吸附趋于饱和；继续延长吸附时间，吸附率变化缓慢，达到吸附平衡。因此，将5 h作为最佳吸附时间。

图2 D101树脂静态吸附平衡曲线

2.2.2 静态解吸动力学曲线

从图3可发现，延长解吸时间，解吸率逐渐升高，变化迅速；当解吸时间为4 h时，树脂对黄酮的解吸基本达到平衡；继续延长解吸时间，解吸率变化不明显。因此，选取4 h为最佳解吸时间。

图3 D101树脂静态解吸平衡曲线

2.3 静态吸附条件优化

2.3.1 样品浓度对吸附效果的影响

从图4可以发现，吸附率随着样液浓度的提高而逐渐降低，吸附量则逐渐增加。这是因为在低浓度条件下，树脂未达到吸附饱和，吸附量过低；提高样品的浓度会使单位表面积的树脂与样品的接触量变大，吸附量增加；同时与黄酮竞争吸附位点的杂质也增多[6,10]，造成其吸附率逐渐下降。因此，选取3 mg·mL-1为最佳吸附样品浓度。

图4 样品浓度对吸附效果的影响

2.3.2 树脂质量对吸附效果的影响

从图5可以发现，加大树脂的质量，黄酮的吸附率呈现上升的趋势，吸附量呈现下降的趋势。这是因为树脂质量的增加，一方面会导致吸附表面积增加，吸附位点数目增加，吸附率上升，继续增加树脂质量，吸附率逐渐趋于平衡；另一方面可能是分布在单位质量树脂表面的黄酮浓度降低使得吸附量下降。为保持较高的吸附率和提高大孔树脂的利用率，确定最佳树脂质量为3 g。

图5 树脂质量对吸附效果的影响

2.3.3 pH对吸附效果的影响

黄酮类化合物的解离程度会受到样品溶液pH影响，因为黄酮类化合物在不同的pH条件下溶解度和存在形式会有所不同，从而影响大孔树脂对它的吸附效果[11]。根据图6可知，随着pH的增大，吸附率和吸附量均先升高再逐渐降低，当pH为4.0时吸附效果最好，吸附率为93.79%。黄酮类化合物因其分子中具有酚羟基，呈弱酸性，在此条件下溶解度降低，易被吸附；在碱性环境中易分解，不易被树脂吸附[12]。因此，最佳吸附pH为4。

图6 pH对吸附效果的影响

2.4 静态解吸条件优化

2.4.1 乙醇洗脱体积分数对解吸效果的影响

从图7可知，树脂中黄酮的解吸率随着乙醇浓度的增加而逐渐提高，当浓度为70%时，解吸率达到最大；继续加大乙醇浓度，解吸率反而下降。可能是因为不同体积分数的乙醇，其极性大小也会不同，乙醇浓度越大，其极性越小，导致树脂上被吸附的其他醇溶性杂质被洗脱下来，而70%的乙醇可能与样品中的黄酮极性相似，解吸效果最好[11]。因此，最佳洗脱剂浓度为70%。

图7 洗脱剂体积分数对解吸效果的影响

2.4.2 洗脱剂用量对解吸效果的影响

由图8可知，当洗脱剂用量＜50 mL时，解吸率随着洗脱剂用量的增加而增大，可能是洗脱液体积较小时，被大孔树脂吸附的黄酮未被完全解吸；继续加大洗脱剂的用量，被洗脱出来的黄酮总量逐渐增大。当洗脱剂用量＞50 mL时，解吸率变化不明显。考虑到减少乙醇成本，选取50 mL乙醇进行洗脱。

图8 洗脱剂用量对解吸效果的影响

2.5 紫苏叶黄酮纯化工艺验证结果

根据上述实验得到的分离纯化工艺条件，按1.3.5方法测定紫苏叶总黄酮的纯度。结果显示，在最佳分离纯化工艺条件下，紫苏叶总黄酮的纯度由39.22%提高至70.90%。

3 结论

通过比较5种不同类型的大孔树脂对紫苏叶总黄酮的分离纯化效果，得出D101型大孔树脂最适用于分离紫苏叶中的总黄酮。同时，选取考察了5个单因素对总黄酮分离纯化的影响，研究发现当样品质量浓度3 mg·mL-1，树脂质量为3 g，pH为4，乙醇浓度为70%，乙醇用量为50 mL时，紫苏叶总黄酮的纯度由39.22%提高至70.90%。