罗伊氏乳杆菌对大鼠不同类型腹泻的影响

王金铭，张如春,2，赵德辉，蔡熙姮，刘晗璐,3※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；3.赤峰学院，内蒙古 赤峰 024000）

腹泻是临床上较为常见的症状之一，通常可以由药物、细菌和病毒等因素所导致。一般感染性的腹泻如细菌感染、病毒感染可以使用抗生素进行治疗，但是对于抗生素的使用存在较大的争议。近年来，微生物组学的研究表明，过度使用、长期使用、不正确使用抗生素以及抗生素的机械特性可能会引起抗生素相关性腹泻（antibiotic-associated diarrhea, AAD）。AAD 被定义为与抗生素联合发生的不明原因腹泻[1]，同时导致一些不良的后果，包括肠道菌群紊乱、假膜性结肠炎等。AAD的机制尚不明确，但目前认为主要是由于肠道微生物群落的破坏以及随后碳水化合物、短链脂肪酸和胆汁酸代谢的变化而导致的渗透性腹泻并对病原体的抵抗能力下降所导致[2]。2019 年国家农业农村部发布194 号公告，我国饲料中全面禁止添加抗生素，以减少滥用抗生素造成的危害，维护动物源食品安全和公共卫生安全，因此寻找新的止泻策略成为研究的焦点。

益生菌被世界卫生组织定义为活的、非致病性的微生物，摄入后对宿主的健康和生理产生积极的影响[3]。在过去的几十年中，益生菌对人和动物健康的有益作用在文献中被大量报道。研究证明了益生菌对多种炎症的辅助治疗效果，如关节炎[4,5]、结膜炎[6]、湿疹[7]和胃肠炎[8]等，其中最重要的就是对炎症性肠病的预防及治疗效果，同时许多研究证实了内源性益生菌在胃肠道疾病中的预防及治疗作用。益生菌主要的机制包括能产生抗菌物质[9]、能够与病原菌竞争性抑制[10]及调节机体免疫系统功能[11]等，其作用机制也在被逐步揭示。目前大部分益生菌改善肠道健康的共同机制是益生菌可以防止或抑制病原体的增殖，抑制病原体产生毒力因子，调节肠道免疫功能，减轻肠道炎症，从而减少后续的感染。近年来，许多研究表明，酵母菌[12]、芽孢杆菌[12]、乳杆菌[13]、双歧杆菌[13]、片球菌、链球菌和放线菌等多种细菌都可以作为益生菌材料，并且乳杆菌被认为是最有潜力的益生菌。已有文献报道罗伊氏乳杆菌对动物[8]和人[14]具有止泻的作用如JIRI HRDY 等[15]研究发现，罗伊氏乳杆菌5454 和动物双歧杆菌5764 改善了三硝基苯磺酸和啮齿枸橼酸杆菌引起的小鼠结肠炎。URBANSKA 等[16]在进行一项罗伊氏乳杆菌17938（L.reuteri17938）治疗儿童各类腹泻病的疗效的研究中发现罗伊氏乳杆菌17938 可缩短腹泻的持续时间并增加治愈的机会。CHEN 等[17]发现罗伊氏乳杆菌可显著预防仔猪大肠杆菌感染引起的腹泻。目前，动物用益生菌大部分分离于禽类、猪及牛等反刍动物和水产动物的胃肠道内容物或排泄物，还有一部分来源于土壤、海洋等环境和植物、发酵食品[18]。本试验采用从健康蓝狐肠道分离获得的罗伊氏乳杆菌，研究其对不同类型腹泻的预防及治疗作用，以期为益生菌资源的开发利用提供实验材料及科学数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株及制备 罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri ZJF036 由本实验室自健康蓝狐肠道中分离、鉴定及保藏；沙门氏菌Salmonella typhimurium ATCC 14028 购于中国微生物菌种保藏中心。

1.1.2 试验动物 2~4 周龄健康SPF 级雌性SD 大鼠，购自长春生物制品研究所有限责任公司；所有大鼠专人饲养，预饲期7 d，饲喂常规大鼠日粮，自由采食、饮水。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组与设计 80 只大鼠随机分为10 组。具体分为正常对照组（NC）、DSS 诱导的腹泻对照组（DSSC）、DSS诱导腹泻治疗组（DSS1）和预防组（DSS2）、沙门氏菌腹泻对照组（STMC）、沙门氏菌腹泻治疗组（STM1）和预防组（STM2）、庆大霉素和头孢拉定相关性腹泻对照组（GCC）、乳酸菌对庆大霉素和头孢拉定相关性腹泻治疗组（GC1）和预防组（GC2）。

DSS 诱导腹泻方法：将DSS 粉末配置成2% 的DSS溶液[19]，自由饮用7 d。沙门氏菌感染诱导腹泻方法：将沙门氏菌发酵液（1 108CFU/mL）按照每天1 mL/只的用量连续灌胃7 d[20]。抗生素相关性腹泻诱导方法：庆大霉素（2 mL，8 万U/支），头孢拉定胶囊，用无菌生理盐水配制成质量浓度为62.5 g/L 的抗生素混合液[21]1 mL/只。将罗伊氏乳杆菌ZJF036 发酵液（1 108CFU/mL）按照每天1 mL/只的用量连续灌胃进行治疗或预防。具体试验设计见图1。

图1 大鼠分组及灌胃情况Fig.1 Grouping and gavage of rats

1.2.2 总增重 试验周期为21 d，分别于试验第0 d、7 d、14 d 和21 d 对所有试验大鼠进行称重，观察比较不同组大鼠的生长情况，绘制总增重图。

1.2.3 试验动物处理及样品采集 试验结束，将全部试验大鼠戊巴比妥钠麻醉，眼球采血后颈椎脱臼处死[22]。采集的血液用于酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA）测定血清中细胞因子水平。

1.2.4 血清中细胞因子水平的测定 促凝采血管收集的血液样本，离心（3 000 r/min、10 min、4 ℃）后收集血清，80 ℃保存备用。采用ELISA 法根据酶联生物科技有限公司生产的ELISA 试剂盒说明书中的操作步骤测定大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12与TNF- 水平。

1.3 数据统计与分析

本试验所得数据使用Microsoft Excel 2019 进行整理后采用SAS中的单因素方差分析（one-way ANOVA）检验差异显著性，试验结果用平均值（Mean）±标准误（SEM）来表示，其中P ＜0.05 为有统计学意义的显著性差异，同时用GraphPad Prism 8 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 罗伊氏乳杆菌对各组大鼠总增重的影响

如图2 所示，图2 A 为DSS 处理各组0~21 d 大鼠总增重情况，与DSSC 组相比DSS2 组总增重显著增高（P ＜0.05）。图2 B 为沙门氏菌处理各组0~21 d大鼠总增重情况，与STMC 组相比STM1、STM2 组大鼠总增重显著增加（P ＜0.05）；图2 C 为GEN ＋CE 处理各组0~21 d 大鼠总增重情况，GC1 和GC2组大鼠总增重与GCC 组相比没有显著差异。说明罗伊氏乳杆菌灌服后对沙门氏菌感染以及DSS 诱导的大鼠体重下降有一定的抑制作用，并且预防作用要大于治疗作用。

图2 各组大鼠0~21 d 总增重Fig.2 Weight gain of rats in 0-21 days

2.2 罗伊氏乳杆菌DSS诱导腹泻大鼠血清免疫学指标的影响

采用ELISA 试剂盒对各组大鼠血清中的IL-2、IL-4、IL-10、IL-12 和TNF- 5 个细胞因子水平进行测定。DSS 组测定结果如下图3，与DSSC 组相比，DSS2组大鼠血清中IL-2、TNF- 和IL-4 的水平显著降低（P ＜0.05），DSS1 组大鼠血清中IL-12、TNF- 的水平显著降低（P ＜0.05）。

图3 DSS 组大鼠血清中（A）IL-2、（B）IL-4、（C）IL-10、（D）IL-12 和（E）TNF- 的水平Fig.3 The levels of(A)IL-2,(B)IL-4,(C)IL-10,(D)IL-12 and(E)TNF- in serum of rats in DSS group

2.3 罗伊氏乳杆菌沙门氏菌诱导腹泻大鼠血清免疫学指标的影响

沙门氏菌组测定结果如下图4，与STMC组相比，STM1 组大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-12 和TNF- 的水平显著降低（P ＜0.05），STM2 组大鼠血清中IL-12的水平显著降低（P ＜0.05）。

图4 沙门氏菌组大鼠血清中（A）IL-2、（B）IL-4、（C）IL-10、（D）IL-12 和（E）TNF- 的水平Fig.4 The levels of(A)IL-2,(B)IL-4,(C)IL-10,(D)IL-12 and(E)TNF- in serum of rats in salmonella group

2.4 罗伊氏乳杆菌庆大霉素＋头孢拉定诱导腹泻大鼠血清免疫学指标的影响

GEN+CE 处理组测定结果如下图5，与GCC 组相比，GC1、GC2 组大鼠血清中IL-2、IL-12 的水平显著降低（P ＜0.05），GC1 组大鼠血清中IL-10 的水平显著提高。GC1 与GC2 对大鼠血清中IL-4 和TNF-的水平没有显著影响。

图5 GEN+CE 组大鼠血清中（A）IL-2、（B）IL-4、（C）IL-10、（D）IL-12 和（E）TNF- 的水平Fig.5 The levels of(A)IL-2,(B)IL-4,(C)IL-10,(D)IL-12 and(E)TNF- in serum of rats in GEN+CE group

3 讨论

DSS 常用作诱导溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）模型，UC 是一种病因不明的直肠和结肠炎性疾病，会导致动物出现血性腹泻、体重减轻、精神沉郁及被毛杂乱等症状[23]。溃疡性结肠炎导致的长期腹泻可引起水电解质紊乱和酸碱平衡失调，影响动物对营养物质的消化吸收，从而使体重减轻。目前益生菌制剂常用于各类腹泻或肠炎的辅助治疗。益生菌的调节机制也是多因素的，包括调节免疫功能、调节肠道屏障功能及调节宿主 微生物稳态等。本实验室在前期的研究中发现罗伊氏乳杆菌ZJF036 具有良好的益生作用，如耐酸、耐胆盐、耐人工胃肠液、对肠上皮细胞有较好的黏附能力以及对大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌的体外抑制作用等[24]。当机体受到外界刺激时会调节促炎细胞因子的增加，同时激发机体的免疫，调节抗炎因子的分泌，进而维持机体的稳态。目前已发现与UC 疾病相关的细胞因子涉及白细胞介素、肿瘤坏死因子和干扰素等[25]。IL-2 是一种控制T 细胞增殖和分化、维持Treg 细胞和NK 细胞激活的免疫调节细胞因子[26]。研究表明敲除小鼠IL-2 基因后可引起小鼠IBD 说明IL-2 在鼠肠炎中起重要作用同时对肠道免疫稳态有调节作用[27]，IL-2 还可诱导2 型淋巴细胞产生抗炎因子10[28]。IL-4、IL-10 具有免疫调节作用，主要是由Th2细胞产生，并且可以抑制中性粒细胞的趋化作用，下调促炎因子的表达和分泌，减轻组织损伤程度，抑制炎症的发展进程[29]。肿瘤坏死因子 是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，并参与正常炎症反应和免疫反应，能通过刺激中性粒细胞和巨噬细胞进而加速细胞的增殖，促进单核细胞等分泌炎性细胞因子进而导致肠道组织受损[30]。在本研究中，探究了罗伊氏乳杆菌ZJF036 在DSS 诱导大鼠腹泻中的作用。结果显示罗伊氏乳杆菌ZJF036 预防处理DSS 诱导的腹泻大鼠可显著缓解大鼠体重下降，说明罗伊氏乳杆菌ZJF036 预防处理可减轻DSS 引起的肠道炎症，这与郑雨星[31]研究结果一致。这一结果可能与罗伊氏乳杆菌参与对肠道屏障功能的维护及改善了造模引起的肠道菌群多样性降低有关。本试验还发现与DSS 对照组相比罗伊氏乳杆菌预防处理和治疗处理分别显著降低了DSS 诱导的腹泻大鼠血清中IL-2 和IL-12 的水平，且显著降低了TNF- 的水平，提高了大鼠血清中IL-10 的水平，说明经罗伊氏乳杆菌ZJF036可减少炎症因子的生成在调节和维持肠道免疫稳态方面有一定的作用。

沙门氏菌是禽类养殖中常见的致病菌，该菌可通过口服被污染的食物和水源等获得，可在多种动物宿主中引起肠炎、腹泻、发热及生长性能低下等。益生菌是一种替代抗生素的添加剂，用于防止或减少养殖中病原体的感染。据报道，许多乳酸杆菌产生的物质具有抗沙门氏菌的抗菌活性[32]。罗伊氏乳杆菌ZJF036 预防处理和治疗处理沙门氏菌感染的腹泻大鼠，可显著缓解大鼠体重下降，并且预防组大鼠体重增重显著高于正常对照组，说明预防的效果要好于治疗的效果。M.NAKPHAICHI等[33]和石水琴[34]研究表明罗伊氏乳杆菌能稳定定植在鸡肠道内同时降低肠道pH，从而显著降低沙门氏菌在鸡肠道内的定植和复制。沙门氏菌穿过肠道屏障后被宿主巨噬细胞吞噬，其在体内的感染涉及Th1 诱导的细胞因子，这些细胞因子中IFN- 是较强大的防御之一，而IL-12 能诱导其产生[35]。罗伊氏乳杆菌预防处理和治疗处理沙门氏菌感染的腹泻大鼠都显著降低了血清中促炎细胞因子IL-2、IL-12 及TNF- 的水平，增加了抗炎细胞因子IL-4 的水平，提示大鼠肠道免疫稳态的恢复。石水琴[34]研究结果表明，罗伊氏乳杆菌在鸡消化系统的各个肠段内均有定殖，主要位于结肠和盲肠，并且可促进鸡肠道屏障的紧密连接和肠上皮细胞的完整性，改善肠道屏障功能。

抗生素相关性腹泻是抗生素使用的常见并发症，可破坏肠道菌群平衡，轻度表现在排便次数及粪便形态上的变化，重度则是由艰难梭菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的大量繁殖引起的假膜性结肠炎、胃肠功能衰竭等临床表现[36]。本试验结果罗伊氏乳杆菌ZJF036对GEN+CE 诱导的腹泻大鼠体重没有显著的影响。与GEN+CE 对照组相比，罗伊氏乳杆菌预防处理和治疗处理都显著降低了大鼠血清中IL-2、IL-12和TNF-的水平。说明罗伊氏乳杆菌的治疗处理和预防处理都能显著缓解GEN+CE 诱导的大鼠抗生素相关性腹泻程度并提高IL-10 水平和降低IL-2、IL-12 和TNF-的水平来改善肠道炎症情况及黏膜屏障的功能，在大鼠腹泻过程中起到保护作用。Lorenzo Drago 等[37]发现罗伊氏乳杆菌LRE02 与鼠李糖乳杆菌LR04 两种益生菌的混合物计量为每天1.2 109CFU 持续30 d可以降低儿童（1 月至18 岁）AAD 的发生率、腹泻天数改善粪便性状。M.KOLODZIEJ[38]的研究在随机、双盲及安慰剂对照实验中，没有发现108CFU/mL 的罗伊氏乳杆菌对口服或者静脉注射抗生素治疗的18 岁以下儿童腹泻有效。所以推测罗伊氏乳杆菌ZJF036 对庆大霉素和头孢拉定诱导的腹泻大鼠总增重没有显著的作用可能与益生菌使用剂量、菌种来源、菌株特异性和持续时间等差异有关[36]。其对于抗生素相关性腹泻的影响及机制未来还需进一步研究。

4 结论

综上所述，蓝狐源罗伊氏乳杆菌ZJF036 对溃疡性结肠炎引起的腹泻、沙门氏菌感染引起的腹泻和抗生素相关性腹泻有一定的防治效果，能缓解由不同原因引起的大鼠肠道炎症、调节抗炎细胞因子和促炎细胞因子水平从而维持肠道免疫稳态。