常氧和低氧条件下二甲双胍对脑胶质瘤细胞代谢的影响

梅蕾，汤旗，厉柳岑，段荣清，沈耀

温州医科大学 检验医学院（生命科学学院），浙江 温州 325035

脑胶质瘤占成人恶性原发性脑肿瘤的75%，脑胶质瘤是起源于神经胶质细胞或前体细胞的神经外胚层肿瘤，包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和室管膜瘤[1]。由于肿瘤的快速和不受控制的增殖限制了O2的供给，血氧供应不足或缺氧是几乎所有实体肿瘤的典型微环境特征，而缺氧是脑胶质瘤的一个标志，组织学上表现为伪栅栏型坏死和血管增生的病理学特征[2]。肿瘤细胞在适应缺氧的同时，导致更具侵袭性和治疗耐药性的肿瘤表型。缺氧诱导 基因表达变化和随后的蛋白质组学变化对各种细胞和生理功能有许多重要影响，最终导致患者预后极差[3]。

二甲双胍是双胍家族的一员，是治疗2型糖尿病最常用的口服降血糖药物，近年来的研究发现其具有抗肿瘤作用[4]。二甲双胍作为一种疏水性药物，可以轻松穿过血脑屏障[5]。通过大量的临床试 验，已被证实二甲双胍可以抑制白血病、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌细胞的生长[6-7]， 但具体机制目前仍不清楚。本研究分析了在常氧和低氧条件下二甲双胍对人脑胶质瘤细胞活力、增殖和代谢等的影响，为深入分析二甲双胍在脑胶质瘤治疗中的作用机制提供重要的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人脑胶质瘤细胞系U251购自中国典型培养保藏中心（武汉）。

1.1.2 主要试剂：二甲双胍、MTT粉末、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Kit试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司；细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物技术股份有限公司；乳酸检测试剂盒购自南京建成生物技术研究院；ATP检测试剂盒（S0026）购自上海碧云天生物技术研究院；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseh, GAPDH）抗体（db106,Human）、肌动蛋白（beta-actin, β-actin）抗体（db13796, Human）、葡萄糖转运蛋白（glucose transporter 1, GLUT1）抗体（db384, Human）和原癌基因（c-Myc-binding protein, c-Myc）抗体（db1667,Human）购自杭州戴格生物技术有限公司。

1.1.3 细胞培养：脑胶质瘤细胞在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（澳洲CLARK公司）的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培养基（美国Gibco公司）中培养，并分别在37 ℃、6% CO2和37 ℃、1% O2、5% CO2恒温培养箱中培养。

1.2 方法

1.2.1 细胞处理：将二甲双胍用DMEM溶解配置成500 mmol/L浓度的溶液，给药时用含10% FBS的DMEM培养液稀释成25 mmol/L作用于对数生长期的脑胶质瘤U251细胞48 h。将替莫唑胺（治疗脑胶质瘤的临床药物）用0.9%氯化钠溶液溶解配置成200 μmol/L浓度的溶液，给药时用培养液稀释成 50 μmol/L作用于对数生长期的U251细胞48 h。

1.2.2 细胞分组：将脑胶质瘤U251细胞以3×103个细胞/孔接种在96孔板。细胞贴壁后，将细胞分为6个处理组进行处理，分别为A1组：常氧对照组；A2组：常氧加25 mmol/L二甲双胍组；A3：常氧加50 μmol/L替莫唑胺组；B1组：低氧对照组；B2组：低氧加25 mmol/L二甲双胍组；B3：低氧加 50 μmol/L替莫唑胺组。

1.2.3 MTT法检测细胞活力：将脑胶质瘤U251细胞以3×103个细胞/孔接种在96孔板。细胞贴壁后，按照分组要求加入含有25 mmol/L二甲双胍的完全培养液，分别放入常氧（21% O2）和低氧（1% O2）培养箱中培养48 h后，在避光条件下，按5 g/L MTT:高糖DMEM=1:9的比例配制检测液，每孔加入100 μL检测液后，放回培养箱孵育4 h，而后取出96孔板吸弃孔中的检测液，每孔加入100 μL DMSO，在避光条件下，于摇床上缓慢晃动15 min。观察到蓝紫色结晶完全溶解后，利用酶标仪SpectraMax iD3（美国Thermo Fisher Scientific公司）检测570 nm波长下的吸光度，进行统计分析。

1.2.4 平板克隆法检测形成的细胞克隆：将脑胶质瘤U251细胞以300个细胞/孔接种在6孔板中，按实验分组进行处理，每组3个复孔，并分别放入常氧和低氧培养箱，之后每隔3～4 d换一次液。待14 d 细胞克隆团形成之后，免疫染色固定液（4%多聚甲醛）固定15 min，用结晶紫染液染色15 min，ddH2O洗至背景清透，晾干后将6孔板水平倒置放在医用观片灯上固定手机的位置后拍照。用ImageJ进行细胞克隆团计数。

1.2.5 EdU细胞增殖检测：将脑胶质瘤细胞U251以3×103个细胞/孔接种在96孔板中，每组细胞做3～6个复孔，按实验分组进行处理，用EdU（胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶掺入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测DNA复制活性，可快速准确的检测细胞的增殖能力）检测试剂盒进行检测后用荧光倒置显微镜ECLIPSE Ti（日本Nikon公司）观察细胞染色情况并拍照记录。

1.2.6 流式细胞术细胞周期检测：按实验分组对脑胶质瘤U251细胞处理后，收集6×104个细胞用碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色20 min后通过流式细胞术分析细胞周期。

1.2.7 细胞代谢物检测：将细胞按3×103个细胞/皿的密度种植于细胞培养大皿中，放置于培养箱培养至细胞贴壁。细胞贴壁后，按上述分组，每组6个大皿，处理48 h。在30 min紫外灯照射的超净工作台中使用灭菌PBS将每皿细胞洗2遍，然后使用乙醇消毒过的细胞刮刀将每组6个大皿的细胞分别收集至已灭菌的1.5 mL EP管内，4 ℃，1 000 r/min 离心20 min，弃上清，封口膜封口后放置于液氮罐中速冻5 min，然后置于-80 ℃暂存待测。称取100 mg 的细胞样品进行液氮研磨。然后加入120 μL 50%甲醇，充分震荡混匀，常温静置10 min。将制备好的提取液置于-20 ℃过夜，使其沉淀每个样品中的蛋白质，然后4 000×g离心20 min，将提取的上清液转移至到96孔板。从每个样品中取出10 μL稀释液混合以作为质控（quality control, QC）样品，每个细胞代谢物样品在上样前均放置于-80 ℃冰箱保存待用。使用超高效液相色谱（UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, 美国）-质谱（Q-Exactive，Thermo Fisher Scientific, 美国）联用仪对细胞代谢物进行检测，对数据进行统计分析。

1.2.8 细胞ATP含量检测：将按实验组处理后的脑胶质瘤U251细胞的细胞皿中的培养液吸除，根据ATP检测试剂盒的操作步骤，在6孔板中每孔加入200 μL试剂盒中的裂解液，用移液器进行反复吹打使裂解液充分接触并充分裂解细胞。将细胞裂解液转移到1.5 mL的EP管中后用离心机4 ℃ 12 000×g离心5 min，取上清液待用。将待用试剂在冰上融解，把ATP标准溶液用ATP检测裂解液稀释成0.01、 0.03、0.1、0.3、1、3和10 μmol/L的浓度。取适量的ATP检测试剂，按照1:9的比例用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂配成ATP工作液，在冰浴上暂时保存。在黑色的96孔板中每孔加入100 μL ATP检测工作液，室温放置5 min，以使本底的ATP全部被消耗掉，从而降低本底的ATP。在96孔板中每孔加入20 μL样品和标准品，迅速用移液器混匀，至少间隔2 s后，用酶标仪中的luminometer测定RLU值，根据标准曲线计算出样品中的ATP浓度。

1.2.9 细胞胞外乳酸含量检测：在空白管、标准 管、测定管中分别加入10 μL的ddH2O、标准品、待测样本。按照乳酸检测试剂盒的操作步骤处理后，用酶标仪在波长530 nm，检测吸光度。

1.2.10 蛋白质印迹法（Western blot）检测GLUT1和c-Myc蛋白的相对表达量：使用RIPA缓冲液从脑胶质瘤U251细胞中提取总蛋白，对样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳法，电泳转移到PVDF膜上。随后，室温下将膜在含5%脱脂牛奶的Tris缓冲液中孵育2 h，然后放入按照说明书比例稀释的一抗管中（β-actin为1:1 000、GAPDH为1:2 000、GLUT1为1:1 000和c-Myc为1:1 000）孵育16 h。与二抗（辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，A0208，1:1 000）孵育2 h。ECL试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）观察免疫印迹，并使用ImageJ软件扫描分析，以GAPDH和β-actin为内参计算上述目标蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS20.0版软件进行统计学分析。正态分布计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 常氧和低氧条件下二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞活力的影响 MTT实验结果显示：在常氧和低氧条件下，与对照组比，25 mmol/L二甲双胍分别处理脑胶质瘤U251细胞48 h后，细胞活力均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；相较于低氧条件下，常氧条件下25 mmol/L二甲双胍处理脑胶质瘤U251细胞48 h后，U251细胞的活力平均降低更显著，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1 二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞活力的影响

2.2 常氧和低氧条件下二甲双胍和替莫唑胺对脑胶质瘤U251细胞形成克隆能力的影响 二甲双胍在常氧和低氧条件下对U251细胞的形成克隆率分别下降至（6.01%±4.52%）和（48.50%±2.80%），而替莫唑胺在常氧和低氧条件下对U251细胞的形成克隆率分别下降至（59.56%±8.61%）和（60.15%±1.77%），50 μmol/L替莫唑胺和25 mmol/L二甲双胍能够明显抑制U251细胞形成克隆（P＜0.01），且二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞的形成克隆能力的抑制作用更明显（P＜0.01），见图2。说明二甲双胍显著抑制了U251细胞形成克隆的能力，且常氧条件下二甲双胍对U251细胞的形成克隆能力影响更大，这与常氧和低氧条件下25 mmol/L二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞活力的影响程度相同。

图2 二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞形成克隆能力的影响

2.3 常氧和低氧条件下二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞增殖能力的影响 EdU实验结果显示：在常氧和低氧条件下，与对照组比，25 mmol/L二甲双胍和50 μmol/L替莫唑胺分别处理脑胶质瘤U251细胞 48 h后EdU阳性细胞数较对照组明显降低（P＜0.01），且常氧条件下的抑制作用更明显（P＜0.01）。见图3。

图3 二甲双胍和替莫唑胺对脑胶质瘤U251细胞增殖的影响

2.4 常氧和低氧条件下二甲双胍对U251细胞的细胞周期的影响 细胞周期实验结果显示，常氧和低氧条件下，与对照组相比，二甲双胍处理U251细胞后呈现GO/G1期阻滞，处于G0/G1期的细胞数明显增加（P＜0.01）。见图4。

图4 二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞周期的影响

2.5 常氧和低氧条件下二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞代谢的影响

2.5.1 差异细胞代谢物定量结果：主成分分析（principal component analysis, PCA）图中的每个点代表一个样本，所有样本之间的异同体现于图中样品的分离、聚集趋势，点的聚集表示观测变量具有高度的相似性，点的离散代表了观测变量有明显的差异性。通过PCA图可以比较直观地看出组内数据的相似性和组间数据的差异性（见图5A）。而从差异代谢物中离子的统计来看，常氧培养条件下，对照组细胞内代谢物中离子含量上调的数值远远高于下调的数值，而加入二甲双胍处理后代谢物中下调的离子数增加；而低氧培养条件下，对照组细胞代谢物中离子含量上调的数值低于下调的数值，而加入二甲双胍后，代谢物中离子含量的变化趋势则与之相反。这表明，在常氧和低氧条件下，二甲双胍的确改变了脑胶质瘤U251细胞的代谢状态（见图5B）。差异代谢物火山图（见图5C、图5D）和差异代谢物热图（见图5E、图5F）也可以得出同样的结论。

图5 二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞代谢的影响

2.5.2 差异代谢物分类统计分析：将筛选出的差异表达离子进行了分类统计分析，主要从糖代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、核苷酸代谢四个方面进行整理。结果显示，常氧和低氧条件下氨基酸代谢差异（见图6A、图6B），包括参与丙氨酸代谢、天冬氨酸代谢、谷氨酸代谢、蛋氨酸代谢、甘氨酸代谢、丝氨酸和苏氨酸代谢等多种氨基酸代谢途径中的氨基酸代谢物含量在经过二甲双胍处理后含量均降低（P＜0.05），其中常氧条件下同时参与三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, TCA）的柠檬酸盐代谢物含量降低，而低氧条件下未发生变化。在脂质代谢方面（见图6C），常氧条件下，二甲双胍主要影响了细胞在甘油磷脂代谢、乙醚脂质代谢、甘油脂代谢等三个代谢途径中的相关代谢物，其中包括sn-甘油-3-磷酸、磷酸胆碱、sn-甘油-3-磷酸胆碱、三乙醇胺、sn-甘油-3-磷酸酯等，但这些代谢物的变化趋势并不完全一致，具体的机制还需进一步探讨，而低氧条件下未发现与脂质代谢相关的代谢物的变化。在核苷酸代谢方面（见图6D、图6E），常氧条件下，二甲双胍主要影响了细胞的嘌呤和嘧啶的代谢，其中包括腺苷、尿苷、腺嘌呤、肌苷等代谢物的含量均出现显著降低（P＜0.01）；低氧条件下，二甲双胍主要影响了细胞的嘌呤代谢，其中鸟嘌呤和脱氧腺苷代谢物的含量降低。因此，我们猜测二甲双胍对脑胶质瘤的抑制作用可能在于抑制DNA的合成。在糖代谢方面（见图6F），低氧条件下二甲双胍降低了半乳糖代谢、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径中的葡萄糖-6-磷酸代谢物的含量且差异有统计学意义（P＜0.05），而在常氧条件下未发现与糖代谢相关的代谢物的变化，因此推测二甲双胍在低氧条件下可能通过抑制糖代谢来减慢脑胶质瘤的增殖和生长。

图6 二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞差异代谢物的分类统计分析

2.6 常氧和低氧条件下二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞ATP的影响 使用ATP检测试剂盒检测细胞内的ATP含量，结果显示，常氧条件下25 mmol/L二甲双胍处理U251细胞48 h后ATP的产生量增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；低氧条件下，25 mmol/L二甲双胍处理U251细胞48 h后ATP的产生量下降，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图7。

图7 二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞ATP含量的影响

2.7 常氧和低氧条件下二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞乳酸的影响 采用乳酸检测试剂盒检测常氧和低氧条件下25 mmol/L二甲双胍处理U251细胞48 h 后乳酸的变化情况，结果显示，常氧条件下二甲双胍处理U251细胞后细胞的乳酸产生量增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；低氧条件下二甲双胍处理U251细胞后细胞的乳酸产生量下降，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图8。

图8 二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞乳酸含量的影响

2.8 常氧和低氧条件下二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞GLUT1和c-Myc蛋白表达的影响 Western blot检测在常氧和低氧条件下25 mmol/L二甲双胍处理脑胶质瘤U251细胞48 h后GLUT1和c-Myc蛋白的表达水平，结果显示，常氧条件下25 mmol/L二甲双胍处理U251细胞48 h后U251细胞内的GLUT1和c-Myc蛋白表达均出现上调，且GLUT1蛋白差异有统计学意义（P＜0.05）；低氧条件下25 mmol/L二甲双胍处理脑胶质瘤U251细胞48 h后U251细胞内的GLUT1和c-Myc蛋白表达均出现下调且差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图9。

图9 二甲双胍对脑胶质瘤U251细胞GLUT1、c-Myc蛋白表达的影响

3 讨论

近年来的研究表明二甲双胍可以安全的作为抗肿瘤药物运用于临床。脑胶质瘤的预后较差，传统治疗目前尚无法获得理想的治疗效果[8]，因此，积极寻找改善胶质瘤预后的新的治疗策略和药物显得尤为重要。在本研究中，我们首先评估了常氧和低氧条件下25 mmol/L二甲双胍作用48 h的抗脑胶质瘤活性，发现二甲双胍对人脑胶质瘤U251细胞活力具有显著的抑制作用。脑胶质瘤随着肿瘤细胞的不断增殖，肿瘤内部氧气供应不足，呈现低氧状态。因此，当氧气缺乏时，细胞依靠糖酵解而不是产生氧气的线粒体代谢来提供能量。然而，即使在氧气存在的情况下，癌细胞也更喜欢在细胞质中进行糖酵解，这一现象首先由Warburg观察到，现在被称为“Warburg效应”或“有氧糖酵解”[9-10]。

低氧可以说是癌症中最具吸引力的治疗靶点之一。目前已经提出了几种靶向缺氧治疗肿瘤细胞的方法，包括缺氧激活前药物、基因治疗和特异性靶向HIF（缺氧诱导因子）或靶向缺氧细胞中重要的通路，如mTOR（雷帕霉素靶蛋白）和UPR（未折叠蛋白反应）通路[11]。本研究结果显示，二甲双胍对低氧条件下的脑胶质瘤细胞增殖、新生及活力具有显著的抑制作用，促进脑胶质瘤细胞细胞周期阻滞，诱导其凋亡，不会因为肿瘤微环境中氧气浓度的改变而出现耐药，而且常氧和低氧条件下抑制作用相似。

在许多癌症中发现糖酵解增强的代谢特征，后来被证实癌细胞中许多与糖酵解有关的酶的蛋白水平及其活性均上调[12]。人们最初认为，癌细胞增强的糖酵解可为其提供能量，以满足癌细胞高增殖的需求[13-14]。

为了探究二甲双胍是否影响脑胶质瘤的糖酵解，我们对二甲双胍处理后的脑胶质瘤细胞的代谢物进行了检测。我们发现在常氧条件下，二甲双胍对脑胶质瘤细胞代谢途径的影响主要在氨基酸、脂质和核苷酸这三个代谢途径；而在低氧条件下，二甲双胍对脑胶质瘤细胞代谢途径的影响除了氨基酸和脂质代谢外，还有糖代谢，能够使脑胶质瘤细胞葡萄糖-6-磷酸代谢物含量明显降低。有研究[15]表明，脑胶质瘤细胞高度依赖糖酵解产生ATP，且当氧气缺乏时，细胞依靠糖酵解而不是消耗氧气的线粒体代谢来提供能量，而糖酵解的每分子葡萄糖产生ATP的效率虽然低，但其产率要比氧化磷酸化的产率快得多，可以满足癌细胞快速生长和增殖的需要。由于二甲双胍是一种阳离子双胍药物，容易在线粒体中积累，在线粒体中它抑制电子传递链（ETC）的复合体I[16-17]。这种ETC抑制会诱导能量应激，促进腺苷单磷酸激酶（AMPK）的激活，随后导致分解代谢，恢复能量稳态[18]。研究[19]表明，二甲双胍减少线粒体依赖的ATP产生和氧消耗，并增加乳酸和糖酵解ATP产生，且缺氧微环境有利于促进糖酵解，增加糖酵解关键酶和乳酸脱氢酶A的活性继而增加乳酸产生。为了确定二甲双胍对脑胶质瘤细胞糖代谢的影响，我们检测了脑胶质瘤细胞ATP和胞外乳酸的含量，发现在低氧条件下二甲双胍对脑胶质瘤细胞的ATP和胞外乳酸的含量无明显改变，其作用机制需要进一步研究探讨；但在常氧条件下，二甲双胍增加了脑胶质瘤U251细胞的ATP和胞外乳酸含量，一部分可能是由于二甲双胍在线粒体中的积累导致细胞发生了能量应激，另一部分可能是通过糖酵解产生。

由GLUT蛋白介导的通过质膜转运葡萄糖是葡萄糖代谢的第一个限速步骤[20]。在许多癌症类型中，由于基因表达的扰动或蛋白质的重新定位或稳定，发现GLUTs的表达出现上调[15]。此外，有大量研 究[21-23]表明，GLUT1在多种癌症中发挥关键作用，如肝细胞癌、乳腺癌、肾癌等，能够促进癌细胞增殖和转移，且抑制癌细胞凋亡。原癌基因c-Myc已被证实可促进癌细胞糖酵解[24-25]，且可以通过直接上调3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶2和乳酸脱氢酶A等基因的表达来增强有氧糖酵解[24]。由于它们能够维持肿瘤细胞进行各种生化程序所需的能量需求，因此它们是开发抗癌策略的有前途的靶点。

在本研究中，我们验证了在常氧和低氧条件下，二甲双胍对人脑胶质瘤细胞活力、增殖以及细胞周期均具有相似的影响。由于糖代谢途径对脑胶质瘤生长和能量获取具有重要作用，我们还发现了低氧条件下二甲双胍对脑胶质瘤细胞的抑制作用部分归因于抑制其糖代谢途径，而二甲双胍是部分通过降低葡萄糖转运蛋白GLUT1、原癌基因c-Myc蛋白表达来发挥作用。

综上所述，本研究结果表明，二甲双胍可能是一种潜在的靶向抗肿瘤的药物，可通过抑制低氧条件下人胶质瘤细胞糖代谢而减慢癌细胞的生长，但具体的机制还有待于进一步研究。