漆酶/TEMPO体系催化氧化处理对黄麻纤维木质素的影响

刘玲 徐帅 王汇锋 董爱学

摘要：采用漆酶/TEMPO体系对黄麻纤维进行催化氧化处理，通过Klason法测定处理前后黄麻纤维中的木质素含量，分别利用凝胶渗透色谱法、有机元素分析法、核磁共振氢谱法测定以二氧六环法从黄麻纤维中提取木质素的分子量及分布、元素含量与化学结构。结果表明：经漆酶/TEMPO处理后黄麻纤维中木质素含量由10.83%降为8.59%，纤维上存留的木质素亦发生了降解，重均分子量由439938 Da降至238704 Da。黄麻纤维经过漆酶/TEMPO体系处理后，木质素的碳元素含量升高，氧元素和—OCH3含量降低，醇羟基数目减少，酚羟基数目稍有下降，并且结构单元的连接方式有所转变，其中β-β、β-1和β-O-4结构比例有所降低，β-5结构增多，说明漆酶/TEMPO催化黄麻纤维木质素发生氧化反应并伴随有一定脱甲基化作用，木质素降解以β-β、β-O-4和β-1键断裂为主，而后形成β-5连接。

关键词：黄麻纤维；木质素；漆酶；TEMPO；氧化

中图分类号：TS192

文献标志码：A

文章编号：1009-265X（2023）02-0185-06

黄麻纤维是世界上产量仅次棉花的第二大天然纤维素纤维，具有强度高、耐摩擦、吸湿散湿快、抑菌、防霉、可降解等性能。黄麻纤维中木质素、半纤维素、果胶等杂质含量较高，导致纤维粗硬、弹性差，限制了其在纺织服装上的应用，常用于加工麻袋、麻布等低档产品。为提高黄麻纤维的可纺性，提高产品附加值，需对其进行精炼处理，传统主要为碱法蒸煮，但环境污染严重；生物法精细化因酶作用的高度专一性、反应条件温和以及加工过程环保而广泛受到关注，但其脱胶率偏低［1-2］；而化学-生物联合法则是将两者相结合，使其兼具化学法精炼彻底和生物法纤维损伤小的优点［3-4］。

漆酶（EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，木质素分子结构中含有的酚羟基可通过漆酶催化氧化而形成自由基，进而引发木质素的降解、聚合或接枝反应［5-6］，因此漆酶在木质素改性领域具有较大应用潜力。然而，由于漆酶的氧化还原电势较低，氧化降解黄麻纤维中的酚型结构木质素的能力有限，其去除木质素效果并不理想。但在一些小分子介体（例如合成介体2，2′-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）与1-羟基苯并三唑（HBT）及天然介体丁香醛、乙酰丁香酮等）的协助下，与漆酶形成漆酶/介体体系（LMS）后，则可进一步氧化降解木素结构中占主要（90%以上）的非酚型单元［7-9］。

漆酶单独处理黄麻纤维，其木质素总体体现为聚合［10］。当介体四甲基哌啶氮氧化物（TEMPO）存在时，木质素转而以降解为主，漆酶/TEMPO催化氧化体系已有研究应用于纸浆的漂白［11-12］。本文采用漆酶/TEMPO催化氧化体系处理黄麻纤维，以酸解称重法测定其木质素的含量变化，以酸性有机溶剂抽提法提取出纤维中的木质素，进行凝胶渗透色谱、有机元素分析、核磁共振氢谱等表征，研究其分子量、化学结构与官能团变化，为以麻纤维为代表的木质纤维素纤维的酶法改性提供参考。

1实验

1.1材料和仪器

材料：黄麻纤维，常熟市奥村龙泰织造有限公司；漆酶（产自Trametes versicolor，酶活不小于0.5U/mg），Sigma（上海）有限公司；TEMPO（98%），阿拉丁科技（上海）有限公司；無水乙酸钠、冰乙酸、硫酸、盐酸、1，4-二氧六环、吡啶、无水乙醚、三氯甲烷、乙酸酐等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

仪器：ICC basic RO15型循环浴槽配套磁力搅拌器（艾卡仪器设备有限公司）；ML/G3型旋转蒸发仪（德国海道夫公司）；TDZ4-WS型低速自动平衡离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；Waters 1515 型凝胶渗透色谱仪（美国Waters公司）；Vario EL III型元素分析仪（德国Elementar公司）；Avance III型400 MHz核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）。

1.2测试与方法

1.2.1黄麻纤维漆酶/TEMPO处理

将1 g黄麻纤维、1.4 mg/mL TEMPO、1.0 U/mL漆酶依次加入到50 mL醋酸-醋酸钠缓冲液（0.2 mol/L， pH 4.5）中，混合摇匀，置于50 ℃循环浴槽中反应12 h。结束后，以80 ℃蒸馏水清洗纤维两次，每次20 min，取出烘干。

1.2.2黄麻纤维木质素含量测定

利用浓硫酸水解法（Klason法）测定黄麻纤维中木质素的含量，具体实验步骤参照文献［13］。

1.2.3黄麻纤维木质素的分离与提纯

为研究黄麻纤维中木质素经漆酶/TEMPO催化氧化处理后的化学结构变化，配制盐酸的二氧六环/水（9∶1）溶液，在相对较低的温度下，回流萃取黄麻纤维，从而制备得到一种分离木质素（称之为二氧六环木质素），具体步骤参照文献［13］。二氧六环木质素的提纯参考Lundqulst等［14］的方法。

1.2.4木质素凝胶渗透色谱测试

将黄麻纤维二氧六环木质素样品溶于N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，质量浓度为20 mg/mL。采用凝胶渗透色谱法测定其分子量及分布，流动相为DMF，流速为1.5 mL/min，进样量为20 μL，色谱柱型号为Shodex KD-802，柱温为35 ℃，采用Waters 2414示差折光检测器，以聚苯乙烯为标准样。

1.2.5木质素有机元素分析

采用有机元素分析仪测定黄麻纤维二氧六环木质素中的C、H、O元素含量。甲氧基含量由核磁共振氢谱计算得到，木质素C9经验式C9HxOy（OCH3）z由文献［13］中所列公式计算得到。

1.2.6木质素核磁共振氢谱测试

按照文献［13］所述方法对黄麻纤维二氧六环木质素进行乙酰化处理。而后，将20 mg乙酰化的木质素样品溶于450 μL氘代氯仿（CDCl3）中，进行核磁共振氢谱（1H-NMR）测试，内标为四甲基硅烷（TMS）。

2结果与讨论

2.1漆酶/TEMPO处理对黄麻纤维木质素含量的影响

漆酶/TEMPO处理前后黄麻纤维中的木质素含量如表1所示。对照黄麻纤维中含有10.83%的木质素，经漆酶/TEMPO处理后其木质素含量降为8.59%。笔者以往研究表明，漆酶单独处理黄麻纤维，其木质素脱除作用并不显著，这是因为漆酶的氧化还原电势较低，只能氧化木质素中的酚型结构单元，而无法对占主要的非酚型结构单元发生作用。但在漆酶/TEMPO体系中，漆酶可快速氧化TEMPO形成自由基，该自由基的氧化还原电势较高，可进一步氧化降解非酚型的木质素，另外TEMPO是一种小分子介体，可以进入纤维深层发生反应，从而使得木质素的去除效率在一定程度上有所提高。

2.2漆酶/TEMPO处理对黄麻纤维木质素分子量及分布的影响

上节中证实，黄麻纤维经漆酶/TEMPO处理后，部分木质素发生降解从纤维中解离下来，而另部分仍存留在纤维上的木质素的聚合或降解情况尚不明晰。本文以二氧六环/水混合酸性溶剂对黄麻纤维进行抽提处理，提取出纤维中存留的木质素，通过GPC法测定其分子量大小及其分布变化。木质素的重均分子量Mw、数均分子量Mn及其多分散系数如表2所示。

结果表明，黄麻纤维经漆酶/TEMPO处理后仍保留在纤维上的木质素也发生了一定程度的降解作用，重均分子量由439938 Da降至238704 Da，数均分子量由236090 Da降至39310 Da。同时，木质素分子的多分散系数由1.86提高至6.07，说明黄麻纤维经漆酶/TEMPO处理后其存留木质素的分子量分布范围变宽，这也从侧面证实了木质素的催化氧化降解。

2.3漆酶/TEMPO处理对黄麻纤维木质素元素构成的影响

黄麻纤维经漆酶/TEMPO处理前后其提取出的二氧六环木质素的碳、氢、氧元素含量、碳氧比、甲氧基含量及C9经验式如表3所示。与对照黄麻纤维的木质素相比，漆酶/TEMPO处理黄麻纤维的木质素碳元素含量增加，氧元素含量降低，C/O值提升。另外，—OCH3含量降低，说明木质素酶促氧化过程中还伴随着脱甲基化作用。

2.4漆酶/TEMPO处理对黄麻纤维木质素化学结构的影响

漆酶/TEMPO处理前后黄麻纤维中提取的二氧六环木质素经乙酰化处理后的1H-NMR色谱图如图1所示，谱图各区段对应的质子归属及其每C9单元的质子数，如表4所示。

结果表明，黄麻纤维经漆酶/TEMPO处理后其木质素的结构单元间连接方式发生了转变，β-β、β-O-4和β-1结构的比例降低，β-5结构增多。这说明漆酶/TEMPO催化木质素氧化降解过程中以β-β、β-O-4和β-1键断裂为主，而后形成β-5连接，如图2所示。

黄麻纤维经漆酶/TEMPO处理前后其木质素的每C9结构单元酚羟基、醇羟基及总羟基的数目，列于表5中。由表5可知，经漆酶/TEMPO处理后黄麻纤维木质素中的醇羟基数目减少，酚羟基数目稍有降低，这是因为漆酶本身的催化底物多为各种多酚类物质，首要作用对象为酚羟基，但在介体TEMPO的协助下，漆酶可将氧化底物范围进一步扩大到醇羟基物质。

3结论

本文采取漆酶/TEMPO氧化体系处理黄麻纤维，通过Klason法测定黄麻纤维处理前后的木质素含量，通过凝胶渗透色谱法、元素分析法、核磁共振氢谱分别测定黄麻纤维上木质素的分子量及分布、元素含量及化学结构。结果表明，对照黄麻纤维中含有10.83%的木质素，经漆酶/TEMPO处理后其木质素含量降为8.59%，部分木质素发生降解作用从纤维上解离下来。仍存留在纤维上的木质素亦存在一定程度的降解，其重均分子量由439938 Da降至238704 Da，数均分子量由236090 Da降至39310 Da，同时多分散系数由1.86增至6.07；木质素的碳元素含量有所增加，氧元素含量降低，甲氧基含量降低，说明木质素在漆酶/TEMPO催化氧化反应过程中伴随有脱甲基化作用；木质素中醇羟基的数目减少，酚羟基数目稍有降低，说明漆酶/TEMPO体系的催化氧化基团由酚羟基扩展至醇羟基，同时木质素结构单元间的连接方式发生了转变，β-β、β-O-4和β-1结构比例降低，β-5结构增多，说明漆酶/TEMPO催化木质素降解过程中以β-β、β-O-4和β-1键断裂为主，而后形成β-5连接。

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Effects of oxidative treatment catalyzed by the laccase/TEMPO system on lignins in jute fibers

L Liuling1， XU Shuai1，2， WANG Huifeng3， DONG Aixue4

（1.Yancheng Polytechnic College， Yancheng 224005， China;

2.Jiangsu Province Engineering Research Center of Biomass Functional Textile Fiber Development and Application， Yancheng 224005， China;

3.Biwei Shenyou Quality and Technical Service Jiangsu Co.， Ltd.， Wuxi 214430， China;

4.Key Laboratory of Eco-Textiles， Ministry of Education， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

Abstract：

In order to improve the spin ability and the added value of jute fibers， it is necessary to refine them. However， traditionally， lkali cooking and oxidation bleaching are mainly adopted to remove impurities such as lignin， but the environment pollution is serious. Biological refinement has attracted wide attention due to its high specificity of enzyme action， mild reaction conditions and environmental protection， but its impurity removal rate is low. The chemical–biological combination method is to combine the two， so that it has the advantages of thorough refinement of the chemical method and little fiber damage of the biological method.

In order to remove impurities such as lignin in jute fibers， the study was based on the fact that laccase， as a copper-containing polyphenol oxidase， can form free radicals by catalytic oxidation with the phenolic hydroxyl group contained in the molecular structure of lignin through laccase， thus triggering degradation， polymerization or grafting reactions of lignin. Based on the mechanism of chemical structure change of lignin in jute fibers after laccase/TEMPO catalytic oxidation treatment， the laccase/TEMPO system was first used for catalytic oxidation of jute fibers， and then the lignin content in jute fibers before and after treatment was determined by the Klason method. The molecular weight， distribution， element content and chemical structure of lignin extracted from jute fibers by the dioxane ring method were determined by gel permeation chromatography， organic element analysis and nuclear magnetic resonance spectrometry. In this paper， we innovated the laccase/TEMPO oxidation system to treat jute fibers， and studied the changes of lignin content， molecular weight， chemical structure and functional groups in jute fibers， revealing the treatment mechanism of jute fibers by the oxidation system.

The results showed that the lignin content in jute fibers decreased from 10.83% to 8.59% after the laccase/TEMPO treatment. The lignin remaining on jute fibers was also degraded， with the weight-average molecular weight decreasing from 439，938 Da to 238，704 Da. For the lignin of laccase/TEMPO-treated jute fibers， its carbon content increased， oxygen content and OCH3 content decreased， and the number of alcohol hydroxyl groups decreased， while the number of phenolic hydroxyl groups decreased slightly. Besides， the connection type between structural units of lignin also changed， with the proportion of β-β， β-O-4 and β-1 structure decreasing and the proportion of β-5 structure increasing. The results indicated that the laccase/TEMPO catalyzed oxidation reaction of jute fiber lignin was accompanied by a certain demethylation， and β-β， β-O-4 and β-1 bonds were mainly broken during lignin degradation and then β-5 links were formed， which was beneficial to the subsequent chemical degradation of lignin and the refinement of jute fibers.

Lignin， a kind of natural polymer with complex three-dimensional amorphous structure， is composed of three basic structural units of p-hydroxyphenyl， guaiacyl and lilac. Laccase （EC1.10.3.2） is a copper-containing polyphenol oxidase. The phenolic hydroxyl group contained in the molecular structure of lignin can be catalyzed by laccase to form free radicals， which can lead to the degradation， polymerization or grafting of lignin. Laccase has great application potential in the field of lignin modification. This paper provides reference for enzymatic modification of lignocellulosic fibers represented by hemp fiber.

Keywords：jute fiber; lignin; laccase; TEMPO; oxidation

收稿日期：20220715

網络出版日期：20221101

基金项目：2022年江苏省科技厅产学研合作项目（BY2022192，BY2022421）；2021年盐城工业职业技术学院横向课题（2021HX-75）；中国博士后科学基金面上资助项目（2021M701452）

作者简介：刘玲（1971—），女，江苏盐城人，副教授，主要从事纺织新材料、新工艺以及纺织品设计与开发方面的研究。