龙血竭总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠Wnt/β-catenin蛋白表达的影响及其临床意义

梁根诚 李岳勇 李昇 黄照河

【摘要】 目的 探討龙血竭总黄酮（SDF）对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）大鼠Wnt/β-catenin蛋白表达的影响及其临床意义。

方法 将50只雄性SD大鼠随机分为5组，每组10只，分别为假手术（sham）组、心肌缺血再灌注模型（MIRI）组、模型+Wnt/β-catenin抑制剂（IWR-1）组、模型+龙血竭总黄酮灌胃（SDF）组、模型+Wnt/β-catenin抑制剂+龙血竭总黄酮灌胃（IWR-1+SDF）组，采用冠状动脉前降支结扎法构建MIRI大鼠模型。TTC染色评价造模情况和SDF对模型的作用效果；蛋白质印迹法（Western blot）检测Wnt2、β-catenin表达水平；ELISA法检测血清血管内皮生长因子（VEGF）水平。

结果 TTC染色结果显示动物造模成功；SDF组Wnt2相对表达量为（1.74±0.18），显著高于sham组的（1.05±0.24）和MIRI组的（0.99±0.12），差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。SDF组β-catenin相对表达量为（0.65±0.08），显著低于sham组的（1.10±0.07），差异有统计学意义（P<0.01）。IWR-1组、SDF组血清VEGF含量显著高于sham组（P<0.05）。

结论 龙血竭总黄酮可以提高MIRI大鼠Wnt2蛋白的表达水平，降低β-catenin的表达水平，对促进血管的生成有益。

【关键词】 龙血竭总黄酮；心肌缺血再灌注损伤；Wnt；β-catenin；血管生成

中图分类号：R285.5；R542.2   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.04.002

Effect of sanguis draconis flavones on Wnt/β-catenin protein expression of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury and its clinical significance

LIANG Gencheng1a，2， LI Yueyong1b， LI Sheng1a，2， HUANG Zhaohe2

（1a. Department of Emergency， 1b. Department of Tumor Intervention， 1. Affiliated Hospital of Youjiang

Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;2. Graduate School，

Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the effect of sanguis draconis flavones （SDF） in Wnt/β-catenin protein expression of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） and its clinical significance.

Methods 50 male SD rats were randomly divided into 5 groups including sham group， MIRI group， model + Wnt/β-catenin inhibitor （IWR-1） group， model + sanguis draconis flavones （SDF） group， and model + IWR-1 + SDF group， with 10 rats in each group. Ligation of left anterior descending artery was used to constructed MIRI models. TTC staining was used to evaluate modeling situation and the effect of SDF on the model. Western blot was used to detect the expression levels of Wnt2 and β-catenin， and ELISA was used to detect the levels of serum vascular endothelial growth factor （VEGF）.

Results TTC staining results showed that the animal models were successfully established. The relative expression of Wnt2 in the SDF group （1.74 ± 0.18） was significantly higher than those in the sham group （1.05 ± 0.24） and the model group （0.99 ± 0.12）， and difference was statistically significant （P<0.05 or 0.01）. The relative expression of β-catenin in the SDF group （0.65 ± 0.08） was significantly lower than that in the sham group （1.10 ± 0.07）， and the difference was statistically significant （P<0.01）. The serum VEGF levels in the IWR-1 group and the SDF group were significantly higher than that in the sham group （P<0.05）.

配置方法：取1.22 mL DMSO溶解5 mg IWR-1粉剂，溶解浓度为4.1 mg/mL，储备液分装为0.5 mL每管，储存于-80 ℃冰箱。取0.5 mL储备液溶解加4.5 mL玉米油稀释，稀释后浓度为0.41 mg/mL，放置于室温备用，工作液于手术当天配置并使用。冠状动脉结扎之后，关闭胸腔之前在结扎部位周围心肌注射IWR-1工作液。IWR-1组、SDF+IWR-1组动物按照0.3 mg/kg用量计算IWR-1溶液的注射体积，其他组注射等体重体积的灭菌PBS。

1.3.3 SDF灌胃给药

称取SDF 1.75 g，加入PEG400∶超纯水=1∶1的混合液35 mL，震荡充分溶解，所得药物浓度为0.05 g/mL。SDF治疗组和SDF+IWR-1组的SDF给药量为180 mg/kg，總黄酮含量按照50%计，以用量360 mg/kg计算给药体积进行灌胃。sham组、MIRI组和IWR-1组每只大鼠按单位体重等体积灌胃PEG400∶超纯水=1∶1的混合液。每天固定时间上午10：00和下午4：00对大鼠进行两次灌胃，连续7天。

1.3.4 大鼠解剖采样、MIRI模型检测及药效测评

各组大鼠在术后7天，麻醉后予颈脱臼处死，充分暴露大鼠的胸腔，心脏（心尖，避开病灶区进针）采血3 mL/只，室温静置30 min后，5000 r/min，10 min离心，分离血清做好标记。样本冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.3.5 ELISA法检测血管内皮生成情况

每组5个血清样本，按照ELISA试剂盒说明书对样品进行VEGF检测，每个样品重复检测3次。

1.3.6 Western blot检测Wnt通路相关蛋白

对每组大鼠心脏样本取心肌梗死区，sham组取对应挂线区，加组织裂解液用组织匀浆机充分裂解，裂解的组织样本于4 ℃，14 000 rpm离心15 min。将上清液移至干净的EP管中待用，用BCA法测定蛋白浓度后，将蛋白样本按照蛋白∶样品缓冲液体积=3∶1的比例混匀，70 ℃加热10 min变性。电泳槽中放入10% Bis-Tris预制胶及Running Buffer，每组上样20 μL，于150 V恒压电泳60 min。取出蛋白凝胶，PVDF膜使用甲醇激活，按负极、海绵、滤纸、蛋白凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵、正极组装转印模块，于20 V恒压转膜90 min。取出PVDF膜，目的蛋白和内参蛋白分开剪膜。各条带使用封闭液在摇床孵育2 h，去除封闭液，加入相应一抗在摇床中4 ℃孵育过夜。TBST清洗3次，每次15 min，加入酶标二抗在摇床中室温孵育1 h。TBST清洗3次，每次15 min，加入ECL显影液避光孵育5 min，使用凝胶成像系统进行拍照。每个样品重复检测3次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0统计软件进行分析，计量资料采用平均数±标准差（±s）描述，多组间均数比较采用方差分析，两两比较用q检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。用GraphPad Prism 8软件进行蛋白质表达量柱状图作图分析。

2 结  果

2.1 MIRI大鼠模型构建

TTC染色是评价缺血损伤常用的指标，与活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲臜，表示细胞的活力。通过TTC染色发现sham组动物整个心脏TTC染色呈红色，无梗死组织（图1A）；MIRI组动物右心室壁有部分区域染色呈白色（图1B）；染色结果显示MIRI组动物符合组织梗死染色特征，表明动物模型构建成功。动物造模50只，手术当天成活43只，成活率86%。造模和灌胃7天后总体成活32只，成活率为64%。

2.2 Wnt通路蛋白Wnt2和β-catenin相对表达量

各组大鼠心肌组织Wnt2的表达量如表1和图2所示。SDF组Wnt2相对表达量显著高于sham组、MIRI组、IWR-1组和SDF+IWR-1组，差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。Western blot检测各组大鼠心肌组织β-catenin的表达量如表1、图3所示。MIRI组β-catenin相对表达量显著低于sham组，差异有统计学意义（P<0.05）；SDF组β-catenin相对表达量显著低于sham组，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3 血清VEGF含量检测

与sham组比较，IWR-1组、SDF组、SDF+IWR-1组的血清VEGF含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。与MIRI组比较，IWR-1组、SDF组的血清VEGF含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨  论

多项研究［11-13］证实龙血竭总黄酮具有很好的预防和治疗心肌缺血再灌注损伤的作用，然而其作用机制报道较少。

近年来的研究阐明Wnt/β-catenin蛋白在心肌缺血再灌注损伤中发挥着重要作用，可能与其促进血管的再生、抗纤维化和抗细胞凋亡等过程有关［13］。李上海等［14］研究表明在心肌缺血再灌注损伤中β-catenin的表达下调能够抑制MIRI的发展。

本文在成功构建了MIRI大鼠模型的基础上，通过对照干预观察大鼠模型疗效作用。发现在MIRI组中Wnt2蛋白表达量无显著变化，而SDF组的Wnt2表达量显著高于sham组和MIRI组，提示SDF的作用与过表达Wnt2蛋白可能有关。Wnt2的主要功能是促进细胞增殖［15］，参与血管生成并在干细胞向血管内皮细胞分化过程中起重要作用［16］，SDF上调Wnt2的表达有利于血管内皮细胞的增殖和心肌组织修复，这对MIRI的康复至关重要。通过检测VEGF的表达量，发现SDF组大鼠VEGF的表达量显著升高。进一步说明SDF可能通过上调Wnt2蛋白，促进血管内皮细胞的增殖以保障心肌组织修复。

β-catenin作为转录因子调控下游基因的表达，主要和细胞凋亡基因的调控有关［15］。通过KEGG查找发现Wnt2和β-catenin呈负向调控关系，Wnt2表达的上调会抑制β-catenin的表达，继而减少细胞凋亡，促进细胞增殖。本研究结果表明，SDF组Wnt2表达显著上调时，该组β-catenin的表达显著下降，血清VEGF的含量显著升高，这说明SDF的作用机制之一可能是通过促进Wnt2的表达，负向调控β-catenin的表达，促进血管的生成并与缓解MIRI引起的损伤有关。

参 考 文 献

［1］  GUDNADOTTIR G S， JAMES S K， ANDERSEN K， et al. Outcomes after STEMI in old multimorbid patients with complex health needs and the effect of invasive management［J］. Am Heart J， 2019， 211：11-21.

［2］ ANSARI M， GOPALAKRISHNAN S， KURIAN G A. Streptozotocin-induced type II diabetic rat administered with nonobesogenic high-fat diet is highly susceptible to myocardial ischemia-reperfusion injury：an insight into the function of mitochondria［J］. J Cell Physiol， 2019， 234（4）：4104-4114.

［3］  李睿，江扬帆，童琳，等.龙血竭总黄酮对免疫性肝纤维化大鼠肝脏中TGF-β1表达的影响［J］. 安徽医科大学学报，2019，54（4）：549-553.

［4］  安海文，李燕林，李李，等.龙血竭胶囊对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究［J］.现代药物与临床，2019，34（3）：577-582.

［5］  张丽，王绪平，黄孝闻，等.血竭及龙血竭化学成分、药理作用研究进展［J］. 中国现代应用药学，2019，36（20）：2605-2611.

［6］  LIU B， WU S， MA J， et al. lncRNA GAS5 reverses EMT and tumor stem cell-mediated gemcitabine resistance and metastasis by targeting miR-221/SOCS3 in pancreatic cancer［J］. Mol Ther Nucleic Acids， 2018， 13：472-482.

［7］  RONG M， CHEN S Y， ZAMBRANO R， et al.  Inhibition of β-catenin signaling protects against CTGF-induced alveolar and vascular pathology in neonatal mouse lung［J］. Pediatr Res， 2016， 80（1）：136-144.

［8］  劉悦，任建军，刘雅，等.七氟醚预处理联合后处理对大鼠心肌缺血再灌注时血栓素A2和前列腺素I2的影响［J］.中华麻醉学杂志，2011，31（2）：240-244.

［9］  贺建东，韩冲芳，董玥颖，等.七氟烷预处理联合后处理对大鼠心肌缺血再灌注时HO-1表达的影响［J］.当代医学，2013，19（8）：1-3.

［10］  梁丽梅，冯湘玲，刘燕，等.龙血竭总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞的保护作用研究［J］.中国临床新医学，2017，10（9）：857-860.

［11］  方伟蓉，李运曼，邓嘉元.龙血竭总黄酮对动物心肌缺血的保护作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2005，10（9）：1020-1024.

［12］  邓嘉元，李运曼，方伟蓉.龙血竭总黄酮对乳鼠损伤心肌细胞的保护作用［J］.中国天然药物，2006，4（5）：373-376.

［13］  綦钰莹，齐雯丽，郑卫红.心肌缺血-再灌注损伤的促损伤性与保护性信号通路研究进展［J］.生命的化学，2020，40（6）：911-918.

［14］  李上海，梁伟钧，张亚娟，等.β结合素与大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制［J］.心脑血管病防治，2014，14（3）：192-194，197.

［15］  肖启程，严光文，田一男，等.Wnt信号配体种类及其在骨代谢中的作用［J］.中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2018，11（6）：613-619.

［16］  夏曦.Id1通过上调Wnt2表达调控内皮祖细胞细胞周期的研究［D］.重庆：第三军医大学，2016.

（收稿日期：2022-12-22 修回日期：2023-03-01）

（编辑：潘明志）