基于网络药理学及药理实验验证探讨仙鹤草抗肝纤维化的作用机制

李麟　赖俐伶　刘华宝

摘要 目的：探究仙鹤草抗肝纤维化的作用机制。方法：根据多种规则筛选仙鹤草化学成分，预测获得靶基因，与肝纤维化发病机制相关的靶点进行比对获得仙鹤草抗肝纤维化的可能作用靶点。通过生物学信息注释库DAVID对关联靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，采用Cytoscape构建仙鹤草化合物-靶点-信号通路相互作用网络图。进一步采用实验验证仙鹤草对大鼠肝星状细胞-T6（HSC-T6）肝纤维化指标α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原1型α1（COL1A1）及蛋白激酶B（AKT）蛋白磷酸化的影响。结果：关键靶点主要为AKT1、STAT3、Caspase-3、Jun、ESR1等，主要参与调控肿瘤信号通路、PI3K/AKT信号通路、肿瘤蛋白聚糖、胰岛素抵抗和FoxO信号通路等。仙鹤草提取物可抑制HSC-T6中α-SMA、COL1A1蛋白的表达，升高AKT的磷酸化水平，验证了网络药理学分析的部分预测结果。结论：仙鹤草可通过作用于PI3K/AKT信号通路等发挥抗肝纤维化作用。

关键词 仙鹤草；肝纤维化；网络药理学；PI3K/AKT信号通路；靶点

Anti-liver Fibrosis Mechanism of Agrimoniae Herba Based on Network Pharmacology and Experimental Verification

LI Lin，LAI Liling，LIU Huabao

（Department of Hepatic Diseases，Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital，Chongqing 400021，China）

Abstract Objective：To explore the anti-liver fibrosis mechanism of Agrimoniae Herba.Methods：The chemical compounds of Agrimoniae Herba were screened out by multiple methods and the target genes were predicted and obtained.The potential targets of Agrimoniae Herba against liver fibrosis were obtained through the comparison with the targets related to the pathogenesis of liver fibrosis.Gene Ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis were carried out for associated targets through DAVID.The chemical compound-target-pathway interaction network was visualized by Cytoscape software.The effects of Agrimoniae Herba on the expression of α-smooth muscle actin（α-SMA） and collagen type 1 alpha 1（COL1A1） and the phosphorylation of protein kinase B（AKT） in rat hepatic stellate cell-T6（HSC-T6） were further verified by experiments.Results：The key targets were mainly AKT1，STAT3，caspase-3，Jun，and ESR1，which were mainly involved in the regulation of tumor signaling pathway，PI3K/AKT signaling pathway，tumor proteoglycans，insulin resistance，FoxO signaling pathway，etc.Agrimoniae Herba extract could inhibit the protein expression of α-SMA and COL1A1 and increase the phosphorylation level of AKT in HSC-T6，which verified the partial prediction results of network pharmacological analysis.Conclusion：Agrimoniae Herba could inhibit liver fibrosis by acting on the PI3K/AKT and other signaling pathways.

Keywords Agrimoniae Herba; Liver fibrosis; Network pharmacology; PI3K/AKT signaling pathway; Target

中图分类号：R285；R282文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.010

肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉积的病理过程，可以表现为肝功能减退、门静脉高压等，可导致肝硬化、肝癌等严重后果［1］。肝纤维化是向肝硬化發展的必经阶段，也是影响慢性肝病预后的重要环节，严重影响了我国人民的身体健康和生命质量［2］。中医药在改善肝纤维化症状、恢复肝功能、改善肝内血液循环，甚至逆转肝纤维化、调节免疫等方面的优势已成为中西医共识［3］。

仙鹤草（Agrimoina pilosa Ledeb.，APL）为蔷薇科多年生草本植物龙芽草的全草，又名脱力草、龙牙草、马鞭草、石打穿等，最早见于《淮南草本》。仙鹤草味苦、涩、平，归肺、肝、脾经，是主要用于治疗各种出血证、痢疾、虚痨等病的传统中药。仙鹤草的主要成分包括酚类、黄酮类、多糖类、三萜类、鞣质、微量元素如Mg、K和P等物质［4］。现代药理学研究表明其具有较强的降血糖、抗肿瘤、抑菌和抗病毒活性［5-7］。本课题组在治疗肝纤维化、肝硬化中应用仙鹤草已有多年经验，临床疗效显著，并在前期研究中发现仙鹤草具有减轻肝纤维化的作用。

然而，目前对仙鹤草抗肝纤维化的作用机制尚缺乏系统的研究，对其作用机制的研究基本限于单个基因或单项病生机制，而中药发挥作用具有多成分、多靶点、多通路等作用特点，因此仙鹤草在逆转肝纤维化中的角色有待系统性的研究。网络药理学从系统层次和生物网络的整体角度出发进行分析，可为中药的研究提供新思路［8］，故本研究拟采用网络药理学的方法构建化合物-靶点-信号通路多层次的网络图，对仙鹤草抗肝纤维化可能的作用机制进行初步探索，并通过实验研究对网络药理学的分析结果进行初步验证，以期为后续的深入研究提供切入点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 大鼠肝星状细胞株HSC（肝星状细胞）-T6由重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所彭明利教授赠送，细胞加入含10%胎牛血清和体积分数为1%的青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。

1.1.2 药物 仙鹤草地上部分干燥全草（四川新荷花中药饮片股份有限公司，批号：2002145）由重庆市中医院肝病科主任医师刘华宝鉴定为仙鹤草（Agrimoina pilosa Ledeb.）的干燥地上部分。

1.1.3 试剂与仪器 DMEM培养基（HyClone公司，美国，货号：SH30809.01），优级胎牛血清（PAN Biotech公司，德国，货号：st30-3302p），蛋白提取试剂盒（碧云天生物技术，货号：p0013B），兔抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth Muscle Actin，α-SMA）单克隆抗体（Cell Signaling公司，美国，货号：8456），胶原1型α1（Collagen Type 1 Alpha 1，COL1A1）单克隆抗体（Cell Signaling公司，美国，货号：91144），兔抗大鼠p-AKT（蛋白激酶B）单克隆抗体（Cell Signaling公司，美国，货号：4058），兔抗大鼠AKT多克隆抗体（Cell Signaling，美国，货号：9272），内参GAPDH多克隆抗体（武汉三鹰生物，货号：10494-1-AP），二抗（杭州联科生物，货号：70-GRT007），IumiQ通用型ECL发光试剂盒（上海圣尔生物，货号：SB-WB012），CCK8细胞计数试剂盒（同仁化学公司，日本，货号：CK04）。二氧化碳培养箱（三洋贸易株式会社，日本，型号：MCO-15AC-SC型），垂直电泳转移装置（Bio-Rad公司，美国，型号：Mini-PROTEAN Tetra 1658001型），Trans-Blot转膜装置（Bio-Rad公司，美国，型号：Mini Trans-Blot Module 1703935型），凝胶成像系统（Bio-Rad公司，美国，型号：CFX96型），脱色摇床（海门市麒麟医用仪器厂，型号：TS-2000A型），酶标仪（Bio-Tek仪器有限公司，美国，型号：ELX800型），高速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：TG16-WS型），-80 ℃低温冰箱（海尔生物医疗股份有限公司，型号：DW-86L388J型）。

1.2 方法

1.2.1 仙鹤草化合物的收集与筛选 通过检索台湾中医药资料库（TCM Database@Taiwan，http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw）、中药分子机制的生物信息学分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm）、网络药理学在线数据库TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid）、化学专业数据库（http：//chemdb.sgst.cn/scdb/default.asp）、中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），收集整理仙鶴草化学成分，并经TCMSP对各化合物进行口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和类药性（Drug Likeness，DL）分析（筛选标准：OB≥30%，DL≥0.18），或根据类药五原则（Lipinski Rule of 5）进行筛选，并检索文献中已报道的仙鹤草主要活性成分。

1.2.2 仙鹤草的靶点预测 使用ChemDraw Professional 16.0统计软件绘制化合物结构，转换为*.mol2格式文件，导入PharmMapper在线平台（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper），采用反向分子对接的方法进行潜在靶点的预测。从有机小分子生物活性数据（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、TCMSP数据库获取化合物Smiles格式，导入SWISS Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch）预测潜在靶点。将获得的结果输入UniProt数据库（http：//www.uniprot.org）校正为官方名称（Official Symbol）。对数据库的预测结果汇总、去重，作为仙鹤草化合物的预测靶点以进一步分析。

1.2.3 肝纤维化发病机制相关靶点的收集 从人类孟德尔遗传在线数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http：//www.omim.org）、疗效靶点数据库（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、综合性药物数据库（Drugbank，https：//www.drugbank.ca）、PolySearch2系统（http：//polysearch.cs.ualberta.ca）、人类基因数据库（The Human Gene Database，GeneCards）（https：//www.genecards.org）分别检索关键词“liver fibrosis”或“hepatic fibrosis”和“cirrhosis”或“hepatocirrhosis”以寻找与肝纤维化相关的基因，利用韦恩图将预测靶点和肝纤维化相关基因进行比对，得到与仙鹤草和肝纤维化相关的关联靶点。

1.2.4 通路注释及“化合物-靶点-信号通路”网络的构建 将获得的靶点导入DAVID数据库（http：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，利用Graphpad Prism软件作图。将得到的化合物、靶点和信号通路导入到String数据库（https：//www.string-db.org/），构建化合物-靶点-信号通路网络图，将结果导入到Cytoscape软件中构建化合物-靶点-信号通路网络图，并利用Network Analyzer插件进行网络拓朴学分析，寻找关键节点和主要成分。

1.2.5 仙鹤草提取物的制备及其对HSC-T6活性和凋亡的影响 称取500 g仙鹤草饮片，加入6倍质量体积的蒸馏水，常温浸泡30 min后煎煮，待煎煮液冷却后过滤，重复3次，合并滤液进行旋蒸浓缩，制成质量浓度为50 mg/mL的仙鹤草提取物（APLE，主要含有仙鹤草酚、仙鹤草素、儿茶素、香豆素、咖啡酸等成分），使用时以DMEM培养基稀释至所需浓度。取对数生长期的大鼠肝星状细胞株HSC-T6，接种于96孔板中，4×103個/孔，200 μL/孔，分别设空白对照组、APLE 0.5 μg/mL组、5 μg/mL组、50 μg/mL组、500 μg/mL组和5 mg/mL组，每组设6个复孔，重复3次。置于细胞培养箱中分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液（5 g/L），继续培养4 h后弃去孔内上清液，加入100 μL的二甲基亚砜，振荡10 min，全波长酶标仪450 nm检测吸光度。细胞增殖抑制率（%）=（1-观察组光密度450平均值/对照组光密度450平均值）×100%。

取对数生长期的HSC-T6接种于96孔板中，4×103个/孔，200 μL/孔，分别设空白对照组、APLE低浓度组（3 μg/mL）、APLE中浓度组（6 μg/mL）、APLE高浓度组（9 μg/mL）处理HSC-T6，48 h后收集细胞，流式细胞技术检测HSC-T6的凋亡情况。

1.2.6 仙鹤草提取物对血小板衍生生长因子-BB（Platelet-derived Growth FactorBB，PDGF-BB）刺激HSC-T6中α-SMA、COL1A1表达的影响 取不同浓度APLE作用于PDGF-BB刺激的HSC-T6，提取细胞总蛋白，与上样缓冲液混匀、100 ℃水浴加热5 min后冷却备用。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，1%脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗孵育60 min。利用凝胶自动成像仪显影，记录条带灰度值，计算α-SMA和COL1A1蛋白相对表达量。

1.2.7 仙鹤草提取物对PDGF-BB刺激HSC-T6中AKT和p-AKT表达的影响 用0.5%小牛血清饥饿同步化过夜处理细胞后，对照组不加药物处理，PDGF-BB组加入终浓度为10 ng/mL的PDGF-BB处理，APLE+PDGF-BB组先加入终浓度为10 μg/mL的APLE处理1 h后再加入终浓度为10 ng/mL的PDGF-BB处理，各组细胞孵育15 min后提取细胞总蛋白，与上样缓冲液混匀、100 ℃水浴加热5 min后冷却备用。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，1%脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗孵育60 min。利用凝胶自动成像仪显影，记录条带灰度值，计算AKT和p-AKT蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件处理数据，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用t检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 仙鹤草的活性成分分析 根据筛选规则，共获得41个化合物。见表1。将筛选出的化合物导入PharmMapper、SWISS数据库进行靶点预测，对结果进行汇总、去重，最终获得预测靶点共528个。与肝纤维化相关的基因进行比对后获得与肝纤维化相关的靶点共72个。

2.2 关联靶点的GO和KEGG结果 对72个关联靶点进行生物学功能注释分析，得到与肝纤维化关联度较高（P<0.01）的GO富集分析结果。仙鹤草抗肝纤维化靶点主要富集的部分生物过程等。见图1。对关联靶点进行信号通路注释，得到与肝纤维化关联程度较高（P<0.01）的部分KEGG富集分析结果。主要富集于Pathways in cancer、PI3K/AKT signaling pathway、Proteoglycans in cancer、Insulin resistance和FoxO signaling pathway等信号通路。见图2。

2.3 仙鹤草抗肝纤维化化合物-靶点-信号通路网络图的建立 关联数目靠前5的化合物分别是（+）-Catechin-5-O-glucoside、Agrimol F、Agrimol G、Agrimol C、Gamma-Sitosterol。网络图中AKT1、STAT3、Caspase-3、Jun、ESR1等基因的连接度排名靠前。见图3。

2.4 仙鹤草提取物对HSC-T6活性和凋亡的影响

随着提取物浓度的增加，HSC-T6的受抑制作用越明显。见表2。与空白对照组或APLE低浓度组比较，APLE中浓度组和高浓度组的细胞凋亡率显著升高。见表3。

2.5 仙鹤草提取物对PDGF-BB刺激后HSC-T6中α-SMA、COL1A1表达的影响 PDGF-BB处理后细胞内α-SMA表达明显增加，加入APLE处理后，α-SMA和COL1A1蛋白的表达均降低。见图4A。

2.6 仙鹤草提取物对PDGF-BB刺激后HSC-T6中AKT和p-AKT表达的影响 PDGF-BB处理后细胞内AKT磷酸化水平明显增加，APLE处理后PDGF-BB刺激的大鼠HSC-T6内AKT磷酸化水平明显受到抑制。见图4B。

3 討论

肝纤维化相当于中医学的“黄疸”“鼓胀”“积聚”等疾患早期，各种病因导致的病理产物且具有共性病理特征。如《素问·平人气象论篇》曰：“溺黄赤安卧者，黄疸，……目黄者曰黄疸。”《难经·五十五难》云：“故积者，五脏所生；聚者，六腑所成也……故以是别知积聚也。”《灵枢·水胀》言：“腹胀，身皆大，大与肤胀等也。色苍黄，腹筋起，此其候也。”中医认为多种因素综合作用于机体，导致肝络瘀滞不通、疏泄失职，肝体失却柔润，而发展为肝纤维化［9］。仙鹤草具有补虚扶正、化瘀散结的功效，现代药理学研究发现仙鹤草主要通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抗氧化等方式发挥作用［10-11］，而鲜有对其抗肝纤维化作用的研究。因此，本研究主要通过网络药理学的方法探究仙鹤草抗肝纤维化的物质基础及作用机制，并进行了初步的实验验证。

本课题组前期临床观察发现中药仙鹤草具有确切的抗肝纤维化作用，且本研究实验验证显示仙鹤草提取物能够降低α-SMA和COL1A1蛋白的表达，减少HSC-T6外基质的沉积，抑制HSC-T6的活化，但其发挥作用的具体机制尚不明确。研究表明仙鹤草可诱导多种细胞凋亡，且本研究也验证了仙鹤草能促进HSC-T6凋亡。从仙鹤草干燥部位中提取的均质多糖能抑制骨肉瘤细胞株U-2 OS的活力并通过胱天蛋白酶-3依赖的线粒体途径诱导细胞凋亡，并且这种抑制作用呈剂量依赖性；体内实验也表明该均质多糖成分对BALB/c裸鼠肿瘤的生长也有抑制作用［12］。张婷婷等［13］发现仙鹤草水提物能显著抑制人肝癌细胞株HepG2增殖，促进其凋亡，可通过上调线粒体凋亡通路中的B细胞淋巴瘤-2-相关X蛋白）、胱天蛋白酶-3表达诱导细胞凋亡。此外，仙鹤草水提液能抑制人肝癌细胞株SMMC-7721，诱导细胞凋亡，其机制可能与下调B细胞淋巴瘤-2蛋白表达及上调P53蛋白表达有关［14］。唐筱璐研究发现中药仙鹤草水煎剂可以诱导SMMC-7721细胞发生凋亡，其机制可能是通过抑制细胞内B细胞淋巴瘤-2蛋白和核因子κB（p65）的表达来实现的［15］。因此，结合本研究分析结果，推测仙鹤草可能是通过抑制HSC-T6增殖、诱导细胞凋亡等机制发挥抗肝纤维化的作用。

本研究对仙鹤草所含化合物及预测的靶点进行了网络拓扑学、GO及信号通路分析，其中PI3K/AKT信号通路已被证实参与肝纤维化发生、发展的多个环节。调控PI3K/AKT信号通路蛋白的表达可抑制HSC增殖、减少细胞外基质的生成与沉积［16］。杨洋［17］发现复方半枝莲颗粒可通过抑制MAPK/ERK-PI3K/AKT信号通路抑制HSC的活化、促进HSC凋亡，从而减轻CCl4肝纤维化模型大鼠的纤维化程度。吴霜［18］发现狗蚁草乙酸乙酯部位能够通过调控PI3K/AKT信号通路相关基因抑制HSC-T6的增殖，改善CCl4所致肝纤维化小鼠肝脏炎症及肝纤维化指标。施凤等［19］发现中药单体熊果酸能阻断PI3K/AKT、P38MAPK信号通路、下调基质金属蛋白酶组织抑制物（Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinasess，TIMP）-1、基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMP）-1蛋白的表达并抑制HSC-T6增殖。因此，深入研究仙鹤草调控PI3K/AKT信号通路的具体分子机制可为进一步开发仙鹤草的临床应用提供新的切入点。本研究实验验证显示经仙鹤草提取物处理后细胞内AKT磷酸化水平明显受到抑制，表明仙鹤草提取物能够通过PI3K/AKT信号通路调控HSC-T6的活性，发挥抗肝纤维化作用。此外，本研究分析发现网络图中连接度靠前的靶点多位于癌症信号通路、癌症中的蛋白聚糖和胰岛素抵抗等信号通路上。慢性乙型肝炎、肝硬化患者多伴有葡萄糖代谢紊乱，该部分患者的纤维化指标多与胰岛素抵抗呈线性正相关［20］，而既往研究及临床应用经验也表明仙鹤草具有抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡、降低血糖、改善胰岛素抵抗等作用［13-14，21］。由DAVID分析结果可知肝纤维化靶点主要富集的生物学功能为细胞代谢、细胞对化学刺激的反应和细胞对含氧化合物的反应等，表明肝纤维化阶段主要为炎症及细胞内基质代谢异常，同时伴随有细胞内氧化应激增加，从而促进细胞内炎症的发展和癌症信号通路的激活。因此，在临床上应用仙鹤草治疗肝纤维化患者，不仅可起到减轻肝纤维化程度、阻止疾病进展的作用，还可起到防癌、减毒的功效。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法，对仙鹤草可能的靶点进行预测、分析，对这些靶点作用的生物学功能及信号通路进行分析，通过构建化合物-靶点-信号通路网络图分析了仙鹤草多成分、多靶点与肝纤维化之间的复杂网络关系，通过实验初步验证了仙鹤草抗肝纤维化的部分药理学作用，探索了可能的作用机制，对进一步深入探讨仙鹤草抗肝纤维化作用机制提供了重要线索。后续将通过动物模型对上述机制研究进行体内实验的验证。

利益冲突声明：无。

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（2021-02-18收稿 本文编辑：张雄杰）

基金项目：重大疑难疾病中西医临床协作试点项目（国中医药办医政发〔2018〕3号-重庆）；成都中医药大学第二批医院专项“杏林学者”学科人才科研提升计划（YYZX20180040）；重庆市科研机构绩效激励引导专项基金（jxyn2020-4）；重庆市技术创新与应用发展专项重点项目（cstc2019jscx-dxwtBX0023）作者简介：李麟（1988.06—），女，博士，主治医师，研究方向：肝纤维化、肝癌中西医治疗，E-mail：lilin515626@126.com