基于网络药理学和分子对接探讨杜仲-牛膝药对治疗强直性脊柱炎机制

李舒 万磊 刘健 黄传兵 李方泽 胡赛赛 陈莹莹 程静 周健

摘要：目的 运用网络药理学和分子对接探讨杜仲-牛膝药对治疗强直性脊柱炎（AS）的关键靶点和分子机制。方法 利用TCMSP数据库检索杜仲-牛膝药对的活性成分，预测其对应靶点；利用GeneCards、OMIM、DrugBank、TTD、PharmGkb数据库检索AS疾病相关靶点，利用Uniprot数据库将预测靶点和疾病靶点名称标准化后筛选出交集靶点，利用Cytoscape3.9.1绘制并分析中药-成分-靶点-疾病网络图。将共同靶点导入STRING数据库获得蛋白质互作网络并利用CytoNCA筛选出核心靶点。将共同靶点导入富集分析库（Metascape）数据库进行GO、KEGG富集分析。利用Auto Dock Tools1.5.7软件进行分子对接。结果 杜仲-牛膝有效活性成分35个，预测对应靶点150个，疾病相关靶点1914个，主要活性成分为槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素，核心靶点为白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素1β（IL-1β）、前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、C-X-C基序趋化因子配体8（CXCL8）。富集分析方面：GO BP主要包括细胞对脂质、有机环化合物和脂多糖反应等；GO MF主要包括细胞因子活性、细胞因子受体结合和受体-配体活性等；GO CC主要包括转录调节复合物、RNA聚合酶II转录调节复合物和膜筏等。KEGG主要包括免疫系统中的细胞因子信号传导通路、白介素相关信号通路、肿瘤坏死因子相关信号通路等。分子对接结果表明主要活性成分可以和核心靶点结合，结合构象稳定。结论 杜仲-牛膝可能通过多种有效成分、多个作用靶点和信号通路发挥抗炎、免疫调节、止痛等生物作用，进而具有治疗AS的作用。

关键词：杜仲-牛膝；强直性脊柱炎；网络药理学；分子对接

中图分类号：R681.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2023）04-0060-08

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种以脊柱强直和韧带骨化为特征的风湿免疫疾病^［1］。疾病发展至中后期，会造成患者中轴脊柱的不可逆损伤，出现脊柱和骶髂关节的融合，导致脊柱活动性降低^［2］。慢性腰背痛为AS常见的症状^［3］，西药的对症治疗以非甾体抗炎药（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）为主^［4］。西医治疗的药物选择还非常有限^［5］，中医辨证施治AS疗效显著^［6］。中医认为AS患者肾精亏虚，督脉失养，肾为先天之本，主骨生髓，肾充则骨强，肝为罢极之本，藏血主筋，肝充则筋骨韧，且肝肾同源，精血相生，肝肾亏虚则筋骨失养、关节疼痛、强直变形，中医治以滋补肝肾、活血强督之剂。杜仲-牛膝为补肝肾、强筋骨、健腰膝经典药对^［7］。然而杜仲-牛膝治疗AS缺乏科学依据来合理解释其协同作用机制，网络药理学是大数据时代背景下，基于生物学、药理学以及多种网络计算平台融合的新兴学科，能系统地分析所有层面的分子机制^［8］。本文利用中药系统药理学分析平台（traditional chinese medicine systems pharmacology database and Analysis platform，TCMSP）平台，分析杜仲-牛膝药物作用靶点与AS疾病靶点，以期更好的探讨杜仲-牛膝治疗AS的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 通过TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以杜仲、牛膝为关键词，检索两药活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，oral bioavailability，OB）≥30%，類药性（drug-like，DL）≥0.18为筛选条件，预测对应的作用靶点。利用全球蛋白质资源（universal protein resource，uniprot）（https：//www.uniprot.org）数据库以“人类（Homo sapiens，H.sapiens）”为物种限定将靶点名称标准化。

1.2 方法

1.2.1 AS疾病相关靶点搜集 以“ankylosing spondylitis”为关键词，在GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（https：//www.omim.org）、DrugBank（https：//go.drugbank.com）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org）中收集AS的相关疾病靶点并利用Uniprot数据库将靶点名称标准化。

1.2.2 药物作用靶点与疾病靶点Venn分析及“中药一活性成分一疾病靶点”网络构建 将上述得到的成分-基因靶点、疾病-基因靶点，导入Venny2.1，得到药物和疾病共同靶点韦恩图，得到并整理杜仲-牛膝有效活性成分调控AS靶基因的网络节点。

1.2.3 PPI网络关系构建及拓扑分析筛选核心靶点 检索互作用基因/蛋白质的搜索工具STRING（https：//string-db.org）分析人类蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系。本研究将共同靶点导入STRING数据库，以“多种蛋白（multiple proteins”）为运行模式，以“H.sapiens”为物种选择，设置信度score≥0.400，其他参数保持默认，构建PPI网络，将所得参数导入Cytoscape，利用CytoNCA插件筛选出核心靶点。

1.2.4 共同靶点富集分析 将获得的共同靶点导入基因功能注释分析工具Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）数据库进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，设置P<0.01，并利用使用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn）进行可视化处理。

1.2.5 关键化学成分和核心靶点分子对接验证 有机小分子生物活性数据数据库PubChem用于获得化合物的化学结构。包含原子坐标，蛋白质结构的其他信息和除蛋白以外生物大分子的信息的PDB数据库用于获得蛋白质结构。利用PubChem数据库下载主要有效成分结构，利用PDB数据库下载核心靶点蛋白结构，利用自动对接工具（AutoDock Tools）软件用于配体—蛋白分子的对接，验证主要有效成分和核心靶点的准确性。

1.2.6 杜仲-牛膝主要活性成分与核心靶点分子对接 利用TCMSP数据库下载杜仲-牛膝主要活性成分的mol2格式，使用AutoDock Tools 1.5.7处理后保存为“pdbqt”格式，作为分子对接配体。在PBD蛋白数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下载核心靶点蛋白结构，运用PyMol软件去除受体蛋白的水分子及原小分子配体，用AutoDock Tools 1.5.7添加非极性氢与电荷后保存为“pdbqt”格式，作为分子对接受体。运用AutoDock Vina进行分子对接，导入配体和受体，设置合适的对接盒子，生成相应的的构象，去除未生成氢键的构象，选择能量最低的构象作为最佳结合构象，保存为PDB格式后用Pymol 2.4将杜仲-牛膝关键活性成分与核心靶点对接结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 杜仲-牛膝有效活性成分及相关作用靶点预测 在TCMSP数据库中筛选杜仲-牛膝的有效活性成分，其中杜仲22个、牛膝16个，删除重复项后共获得药对有效活性成分35个。在TCMSP数据库对有效活性成分作用靶点进行预测，其中杜仲397个、牛膝358个。利用Uniprot数据库标准化命名后删除重复项，共获得预测靶点150个。

2.2 AS疾病相关靶点 利用GeneCards、OMIM、DrugBank、TTD、PharmGkb 5个数据库分别收集到相关疾病靶点1918个、36个、123个、5个和1个，利用Uniprot数据库标准化命名并删除重复项后，共获得1949个AS疾病相关靶点。

2.3 共同靶点获得及相关网络构建 利用Venny2.1对杜仲-牛膝药对作用靶点及AS疾病相关靶点进行Venn分析，获得共同靶点67个（图1），为杜仲-牛膝药对治疗AS的可能作用靶点。利用Cytoscape3.9.1软件构建“中药-活性成分-共同靶点-疾病”图，并对其进行拓扑分析。其中蓝色代表共同靶点，绿色代表杜仲，橙色代表牛膝，紫色代表2种，红色代表AS，中药共有的活性成分，形状越大、代表在网络图中的地位越重要（图2）。在网络中共有255个节点，882条边，其中等级（degree）值排名前五的有效活性成分为槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素。（表1、表2）。

2.4 PPI网络构建及核心靶点筛选 将67个潜在作用靶点导入STRING数据库，获得的PPI网络导入 Cytoscape 软件进行分析。通过筛选获得一个由65个节点，748条边组成的核心作用靶点网络。根据靶点间连接 degree 值进行分层获得核心靶点6个，重要靶点21个，次要靶点38个（图3），将degree值排名前20的蛋白筛选出来（图4），degree 值排序在前列的6个核心靶点有白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、血管內皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、C-X-C基序趋化因子配体8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）。图3中degree值越大，节点越大，颜色越深，靶点间联系越紧密，连线越粗，这6个核心靶点蛋白间互作影响力最强，能在复杂的疾病调节网络中直接或间接影响其他大部分靶点通路，可能是该药对治疗AS的关键靶点。

2.5 杜仲-牛膝与AS交集靶点GO和KEGG富集分析 运用Metascape数据平台对杜仲-牛膝和AS的交集靶点进行GO和KEGG富集分析。运用微生信平台进行可视化处理后得到如下KEGG分析图和GO分析图（图5、图6）。可见交集靶点参与的GO生物过程（biological process，BP）主要包括细胞对脂质、有机环化合物、脂多糖、细菌源性分子、炎症、细菌生物刺激及白细胞介素-8产生的调节反应等。交集靶点主要GO分子功能（molecular function，MF）富集在细胞因子活性、细胞因子受体结合、受体-配体活性、信号受体激活剂活性、信号受体调节活性、生长因子受体结合、生长因子活性、DNA结合转录因子结合、核受体活性、配体激活转录因子活性等。交集靶点参与GO细胞组分（cellular components，CC）富集在转录调节复合物、RNA聚合酶II转录调节复合物、膜筏、膜微区、小窝、质膜筏、核膜、丝氨酸型肽酶复合物、质膜外侧、膜侧等。KEGG富集分析发现参与通路主要有免疫系统中的细胞因子信号传导通路、白介素相关信号通路、肿瘤坏死因子相关信号通路、脂多糖应答相关信号通路、炎症反应相关信号通路等，这进一步解释了杜仲-牛膝治疗AS的潜在机制，通过分析发现参与的通路表明杜仲-牛膝可能参与相关疾病的调节。

2.6 杜仲-牛膝主要活性成分与核心靶点分子对接 通过分子对接技术对网络药理学结果进一步分析，筛选网络中度值较高的有效成分和靶点进行对接，对杜仲-牛膝中有效成分治疗AS的能力进行预测打分。根据表2分析结果，在选择度值的情况下同时考虑每个药物，故筛选来自杜仲-牛膝的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇，牛膝的汉黄芩素，这4个成分作为对接配体。根据图4分析结果，选取度值排名前5的核心靶点作为对接受体：IL-6、TNF、IL-1β、PTGS2、VEGFA，用结合能（Affinity）来评估成分与靶点的结合能力，结合能<0表明可以自由结合，结合能越低表明配体与受体之间的亲和力越大，二者发生相互作用的可能性就越高。由于数据较多，故展示排名前20位的对接结果见表3。利用Pymol软件对部分分子对接结果进行可视化处理（图7），其中蓝色为蛋白受体，绿色为小分子配体，黄色虚线为配体与受体之间形成的氢键，表示配体与受体之间的结合较稳定。分子对接结果显示成分与靶点能够较好结合。

3 讨论

在本研究中，通过网络药理学方法筛选出了35个杜仲-牛膝的活性成分和67个与AS相关的靶点。结果表明，杜仲-牛膝在多组分和多目标组合治疗AS中发挥作用，对治疗AS具有潜在优势。根据“活性成分-疾病-核心靶信号通路”网络的拓扑分析结果发现，此次筛选出的核心成分多数存在抗炎、免疫调节、止痛等作用。

杜仲、牛膝共有成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇，且三种成分的degree值在所有成分中前三，体现了杜仲-牛膝药对配伍的相须作用。槲皮素为黄酮类植物多酚，是一种众所周知的抗氧化剂^［9］。有研究表明，槲皮素是具有镇痛特性的药物，可以辅助非甾体抗炎药，而且对肾脏和胃肠道的副作用更少^［10］。山奈酚通过调节炎症、血管生成和氧化应激发挥保护机体作用^［11-12］。β-谷甾醇通过下调IKKβ/NF-κB和JNK）信号通路改善脂肪组织中的炎症^［13］。牛膝的主要成分为汉黄芩素，汉黄芩素具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，可显著抑制炎症反应^［14］。本研究选取排名前4的活性成分和排名前5的核心靶点基因，其分子对接分别为IL-6、TNF、IL-1β、PTGS2、VEGFA。这些靶基因主要涉及炎症、疼痛、血管内皮生成等。IL-6是先天性免疫的关键细胞因子，具有广泛的生理功能，传统上与宿主防御、免疫细胞调节、增殖和分化有关^［15］。TNF是一种多效性细胞因子，是炎症中的重要细胞因子。TNF-a拮抗剂靶向治疗在减少AS轴向和外周症状、减缓疾病进展、改善患者功能和生活质量方面显示出快速和一致的有效性^［16］。IL-1β是炎症反应的关键介质。它对宿主反应和对病原体的抵抗至關重要，但是在慢性疾病和急性组织损伤期间也会加剧损害^［17］。有研究表明，抗IL-1β和抗TNF-a治疗可能有缓解椎间盘退变和下腰痛的效果^［18］。PTGS2也被称作环氧化酶2（COX-2），COX-2选择性抑制剂在镇痛、抗炎方面具有与NSAIDs类似的明确疗效，且与NSAIDs相比，COX-2选择性抑制剂与胃十二指肠损伤的显著减少相关^［19］，这些天然药物替代品是药物化学研究的热点^［20］。VEGF-VEGFR信号是抑制包括炎症在内的各种疾病的重要靶点^［21］。通过对AS以上作用机制的分析，为进一步预测杜仲-牛膝对AS的治疗机制，我们对GO和KEGG通路进行了富集分析。结果显示，杜仲-牛膝参与AS生物过程中的细胞对脂质、有机环化合物和脂多糖反应等，生物分子功能中的细胞因子活性、细胞因子受体结合和受体-配体活性等，生物组分中的转录调节复合物、RNA聚合酶II转录调节复合物和膜筏等。KEGG显示杜仲-牛膝治疗AS涉及到了免疫系统中的细胞因子信号传导通路、白介素相关信号通路、肿瘤坏死因子相关信号通路等，这些通路在AS的免疫调节、炎症反应、预后和转归均具有重要意义。

综上所述，本研究综合了网络药理学和分子对接，初步从分子水平上展示了杜仲-牛膝的多组分、多靶点、多通道治疗AS的现代应用价值，从而为杜仲-牛膝临床配伍治疗AS提供指导意义。

参考文献：

［1］Mehkri Y，Lara-Velazquez M，Fiester P，et al.Ankylosing spondylitis traumatic subaxial cervical fractures-An updated treatment algorithm［J］.J Craniovertebr Junction Spine，2021，12（4）：329-335.

［2］Bergman M，Lundholm A.Managing morbidity and treatment-related toxicity in patients with ankylosing spondylitis［J］.Rheumatology（Oxford），2018，57（3）：419-428.

［3］Golder V，Schachna L.Ankylosing spondylitis：an update［J］.Aust Fam Physician，2013，42（11）：780-784.

［4］Kroon FP，Burg LR，Ramiro S，et al.Non-steroidal anti-inflammatory drugs（NSAIDs）for axial spondyloarthritis（ankylosing spondylitis and non-radiographic axial spondyloarthritis）［J］.Cochrane Database Syst Rev，2015，15（7）：CD010952.

［5］Sari ?，?ztürk MA，Akko? N.Treatment of ankylosing spondylitis［J］.Turk J Med Sci，2015；45（2）：416-430.

［6］馮兴华，姜泉，刘宏潇，等.中医辨证治疗强直性脊柱炎的临床疗效评价［J］.中国中西医结合杂志，2013，33（10）：1309-1314.

［7］许凤全，冯兴华.治疗强直性脊柱炎常用中药处方及药对分析［J］.中国中医药信息杂志，2009，16（1）：97-98.

［8］Luo TT，Lu Y，Yan SK，et al.Network pharmacology in research of Chinese Medicine Formula：Methodology，application and prospective［J］.Chin J Integr Med，2020，26（1）：72-80.

［9］Liu W，Zhou Y，Qin Y，et al.Quercetin intervention alleviates offspring's oxidative stress，inflammation，and tight junction damage in the colon induced by maternal fine particulate matter（PM 2.5）exposure through the reduction of bacteroides［J］.Nutrients，2020，12（10）：3095.

［10］Carullo G，Cappello AR，Frattaruolo L，et al.Quercetin and derivatives：useful tools in inflammation and pain management［J］.Future Med Chem，2017，9（1）：79-93.

［11］Romero-Juárez P A，Visco D B，Manh?es-de-Castro R，et al.Dietary flavonoid kaempferol reduces obesity-associated hypothalamic microglia activation and promotes body weight loss in mice with obesity［J］.Nutr Neurosci，2023，26（1）：25-39.

［12］Li S，Hao M，Wu T，et al.Kaempferol alleviates human endothelial cell injury through circNOL12/miR-6873-3p/FRS2 axis［J］.Biomed Pharmacother，2021，137：111419.

［13］Jayaraman S，Devarajan N，Rajagopal P，et al.β-Sitosterol Circumvents Obesity Induced Inflammation and Insulin Resistance by down-Regulating IKKβ/NF-κB and JNK Signaling Pathway in Adipocytes of Type 2 Diabetic Rats［J］.Molecules，2021，26（7）：2101.

［14］Yu W，Xu Z，Gao Q，et al.Protective role of wogonin against cadmium induced testicular toxicity：Involvement of antioxidant，anti-inflammatory and anti-apoptotic pathways［J］.Life Sci，2020，258（20）：118192.

［15］Ridker PM，Rane M.Interleukin-6 Signaling and Anti-Interleukin-6 Therapeutics in Cardiovascular Disease［J］.Circ Res，2021，128（11）：1728-1746.

［16］Clegg DO.Treatment of ankylosing spondylitis［J］.J Rheumatol Suppl，2006，78（6）：24-31.

［17］Lopez-Castejon G，Brough D.Understanding the mechanism of IL-1β secretion［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2011，22（4）：189-195.

［18］Wang Y，Che M，Xin J，et al.The role of IL-1β and TNF-α in intervertebral disc degeneration［J］.Biomed Pharmacother，2020，131（20）：110660.

［19］Ballinger A，Smith G.COX-2 inhibitors vs.NSAIDs in gastrointestinal damage and prevention［J］.Expert Opin Pharmacother，2001，2（1）：31-40.

［20］Cui J，Jia J.Natural COX-2 Inhibitors as Promising Anti-inflammatory Agents：An Update［J］.Curr Med Chem，2021，28（18）：3622-3646.

［21］Shibuya M.VEGF-VEGFR System as a Target for Suppressing Inflammation and other Diseases［J］.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2015，15（2）：135-144.

（收稿日期：2022-06-29）