穿心莲海藻糖-6-磷酸合酶1(ApTPS1)生物信息学与表达分析

黄雪静,简少芬,刘爱佳,雷 明,钟 楚,缪剑华,,

(1.广西医科大学 药学院,南宁 530021;2.广西壮族自治区药用植物园广西药用资源保护与遗传改良重点实验室,南宁 530023;3.广西壮族自治区药用植物园广西中药资源智慧创制工程研究中心,南宁 530023;4.广西中医药大学 药学院,南宁 530200)

植物花芽分化是从营养生长期向生殖生长期转化的重要标志,开花期是关系到植物繁衍后代的重要生育时期[1-3]。植物的开花时间主要受五个遗传途径调控:内源性衰老[4-5]、赤霉素途径[6]、光周期诱导[7]、春化途径[8]和自主途径[9]。植物从营养生长期向生殖生长期过渡,伴随着体内碳水化合物积累的变化[10-12]。例如,石蒜的可溶性糖含量在叶期、花期和花期后呈先上升后下降再回升趋势,淀粉含量在叶期至花芽期呈上升趋势[13];咖啡开花后叶片可溶性糖和淀粉含量呈下降趋势[14];全叶马兰开花前后根部的可溶性碳水化合物呈先下降后持续上升趋势[15];拟南芥无淀粉粒突变体pgm和淀粉合成过表达体sex1在光照短于16 h时都具有晚开花表型[16]。此外,外源施加蔗糖、海藻糖等能够直接或间接地调节拟南芥叶片中蔗糖浓度及淀粉的积累或降解,促使其由叶期向花期转换[4,17-23]。这些研究结果表明,碳水化合物在植物开花时间的调控中扮演了重要角色。

植物体内碳水化合物中的海藻糖-6-磷酸(Trehalose 6-phosphate,T6P)被认为是调控植物开花的关键代谢物[21-22,24-25],其由海藻糖-6-磷酸合酶(Trehalose 6-phosphate synthase,TPS)催化葡萄糖-6-磷酸(Glucose 6-phosphate,G6P)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)反应生成,T6P进一步由海藻糖磷酸磷酸化酶(Trehalose 6-phosphate phosphatase,TPP)去磷酸化作用生成海藻糖和无机磷酸盐[23,26-27],而后经海藻糖酶降解为葡萄糖。在模式植物拟南芥中,有11个AtTPSs和10个AtTPPs基因分别调控T6P合成和代谢。不同的AtTPS基因在拟南芥不同器官中表达模式存在较大差异[25,28],其中AtTPS1在野生型胚胎发育过程中的表达不断增加,在幼苗、根、叶、茎、花和果实中均能观察到。AtTPS1能够调控植物开花时间,其介导合成的T6P还能促进胚胎发育和种子萌发[4,24]。AtTPS1缺失突变体植株发育严重不良,根系生长减少,不能开花甚至胚胎致死[25,29-30],而拟南芥过表达TPS1则生长速度明显快于野生型,且能够促进海藻糖-6-磷酸积累并提前开花[29]。这些研究结果表明,TPS1在控制植物开花过程中起着关键作用。

开花期也是1年生药用植物活性成分积累的关键时期。研究表明,开花前黄芩地上部的黄酮类有效成分黄芩苷、黄芩素最高,开花后根部的黄芩苷快速积累而茎叶的黄芩苷含量则显著下降[31-32];野老鹳草在开花后酚类有效成分没食子酸及鞣花酸的含量上升,在果期最高[33];穿心莲则在始花期时其二萜内酯类有效成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量最高,且盛花期二者含量开始下降[34]。因此,调控植物开花期对药用植物活性成分的生产及新品种的选育和改良具有重要意义。

有关TPS基因克隆和遗传转化方面的研究在拟南芥[25-26]、木薯[35]、茶树[36]、丹参[37]、玉米[38]、百合花[39]等植物中已有相关报道,在模式植物拟南芥中对AtTPS1基因的克隆和遗传调控的研究比较深入[4,25-30]。然而,目前尚未有穿心莲中关于TPS1基因的相关报道。本文在对穿心莲海藻糖-6-磷酸合酶1基因(命名为ApTPS1)的生物信息学分析的基础上,比较穿心莲不同器官、不同生态型及其在不同光周期下该基因的表达差异,旨在明确ApTPS1与穿心莲开花期的关系,为后期进一步研究ApTPS1调控穿心莲开花期与内酯合成的关系及穿心莲优良品种的选育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

以爵床科穿心莲属植物穿心莲(Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees)为试验材料,通过系统选育筛选出开花期存在明显差异的4株植株(早花型和晚花型各2株),经3代纯化,选择性状稳定且一致的后代种子用于本研究。

穿心莲种子于2021年谷雨(4月20日)播种,6月1日大田移栽。移栽时幼苗3对真叶,种植株行距为20 cm×30 cm,统一水肥管理。早花型材料于8月下旬进入开花期,晚花型材料于9月下旬进入开花期。于2021年8月14日取两个材料上部叶片及老叶、新叶、花蕾、已开放的花和未成熟果实(幼果),液氮冷冻,-80 ℃保存,用于RNA提取。

光周期试验在人工光照培养室进行,以早花型和晚花型各1个材料为研究对象。幼苗长至第1对真叶时移栽到花盆中进行土培,将两个材料分别置于短光照(10 h/14 h,光/暗,下同)、中光照(12 h/12 h)和长光照(14 h/10 h)条件下,光量子通量密度为200 μmol·m-2·s-1。统一水分管理。生长1个月后取新鲜叶片提取总RNA,反转录后进行ApTPS1基因的表达量测定。

1.2 ApTPS1基因的克隆

新鲜叶片样品用液氮冷冻后-80 ℃保存。将冷冻的穿心莲样品置于液氮预冷的灭菌研钵中,加入液氮将其磨碎后,利用Trans Zol Up Plus RNA Kit试剂盒(全式金生物,北京)提取穿心莲叶片总RNA,以总RNA为模板,采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthsisSuperMix试剂盒(全式金生物,北京)合成cDNA第一链。根据广西药用资源保护与遗传改良重点实验室测得的穿心莲全长转录组序列集筛选到ApTPS1基因序列,利用 Primer 5.0 软件设计cDNA全长克隆引物:正向引物GGGGAAAGGACCATCACAATCAAAT;反向引物CAAACAAACTTATAGAGAGTGAACTCATTCCAC。以穿心莲叶片cDNA为模板,采用普通PCR方法克隆ApTPS1基因,扩增反应体系为:cDNA 1.5 μL,正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL,KOD高保真酶1 μL,10×Buffer 5 μL,dNTPs(2 mmol·L-1)5 μL, MgSO4(25 mmol·L-1)3 μL,加RNase-free ddH2O至总体积50 μL。PCR反应程序为: 94 ℃,2 min;98 ℃,10 s;54 ℃,30 s;68 ℃,2.5 min; 72 ℃,5 min;4 ℃保存。扩增产物在室温条件下连接到通用载体pCE2-TA/Blunt-Zero vector(诺唯赞生物,南京),转化到大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(全式金生物,北京),将转化产物均匀涂抹在含有X-gal、ITPG和卡那霉素的LB固体培养基上,封膜后37 ℃倒置培养 12 h,用灭菌枪头挑取白色阳性单菌落,置于含有卡那霉素的LB液体培养基中,37 ℃、200 r·min-1条件培养 12 h。选取浑浊的菌液采用通用引物M13R和M13F进行菌液PCR,经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,选取阳性克隆菌液送至北京擎科生物科技有限公司测序。

1.3 生物信息学分析

利用 NCBI在线工具 ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)、CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找该序列的开放阅读框、蛋白保守结构域和同源序列;ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam)在线分析分子特性,ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)在线预测蛋白/亲疏水性,SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? Signal P-5.0)进行信号肽分析,TRMHMM server v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHM M-2.0/)进行跨膜结构域分析;使用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)工具分析蛋白二级结构,SWISS-MODEL(https://www.expasy.org/resources/swiss-model)在线预测蛋白三级结构;利用PSORTⅡ pre-diction(https://psort.hgc.jp/form2.html)预测亚细胞定位;利用DNAMAN软件进行多重序列比对;利用 MEGA-X软件邻接法构建系统进化树,节点支持率使用 100 次 Bootstrap 检验。

1.4 ApTPS1基因表达量测定

采用qRT-PCR方法分析不同表型材料、不同器官及不同光周期条件下穿心莲ApTPS1基因的表达水平,利用Primer 5.0 软件设计qRT-PCR引物:正向引物AGGACTTTGCCATCTC-G;反向引物TACACCGCAGCTACACG。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。qRT-PCR反应体系按照试剂盒说明书(全式金生物,北京):cDNA 2 μL,正反向引物各0.4 μL,2×Perfect StartTMGreen qPCR Super Mix 10 μL,Passive Reference Dye(50×)0.4 μL,加RNase-free ddH2O至总体积20 μL。反应程序为:Hold stage:1.6 ℃·s-1,94 ℃,30 s。PCR stage: 1.6 ℃·s-1,94 ℃,5 s;60 ℃,15 s;72 ℃,10 s,共40个循环。Melt Curve stage: 1.6 ℃·s-1,95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;95 ℃,1 s。采用2-△△Ct法进行相对定量分析。

1.5 数据分析

采用Excel 2013对数据进行处理和作图,显著性检验采用SPSS 19.0软件中单因素方差分析、独立样本t检验等方法进行分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 ApTPS1基因克隆及分子特性分析

以穿心莲叶片cDNA为模板,利用设计的全长引物克隆,将目的片段连接到通用载体pCE2-TA/Blunt-Zero vector中,采用M13双向测序、拼接后得到一条3 354 bp的序列,与预期大小相近(图1),与转录组数据库中的序列一致,命名为ApTPS1。对该基因保守区预判,显示该基因编码的蛋白质同时具有N端的TPS(位于1 397～ 2 794 bp)和C端的TPP(位于638～1 300 bp)保守结构域,C端TPP结构域缺乏磷酸水解酶/磷酸转移酶的3个保守基序(LDYD—GD—T—LM—和 GDDRSD)[40]。对其分子特性进行分析,结果显示ApTPS1包含一个2 787 bp的开放阅读框,编码928个氨基酸残基,其中含量最高为亮氨酸(Leu),含量最低为半胱氨酸(Cys);蛋白质分子质量为105 178.82 u,理论等电点(pI)为6.67,酸性氨基酸有109个,碱性氨基酸有114个;亲水性(GRAVY)为 -0.453,属于亲水性蛋白;不稳定指数为45.08,属于不稳定蛋白;信号肽分析显示该蛋白无信号肽;跨膜域分析结果表明ApTPS1蛋白为非跨膜蛋白。

a.穿心莲 ApTPS1的普通PCR扩增结果;M.DNA 标准分子量(DL5000);1. ApTPS1的PCR扩增产物; b.穿心莲 ApTPS1的通用载体构建,插入位点为TOPO binging site(412～421 bp)a.the normal PCR amplification of ApTPS1 of Andrographis paniculata;M.DNA marker(DL5000);1.PCR amplification product of ApTPS1;b.indicates the general vector construction of ApTPS1 of Andrographis paniculata,the insertion site is TOPO binging site (412-421 bp)图1 穿心莲 ApTPS1的克隆Fig.1 Cloning of ApTPS1 of Andrographis paniculata

2.2 ApTPS1同源性比对及系统进化树分析

NCBI BLAST结果显示,穿心莲TPS1氨基酸序列与丹参Salviasplendens(XP_042042550.1)、凤梨Handroanthusimpetiginosus(PIN19818.1)、芝麻Sesamumindicum(XP_011098162.1)、烟草Nicotianatabacum(NP_001312790.1)、松蒿Phtheirospermumjaponicum(GFP78691.1)、山茶Camelliasinensis(XP_028106857.1)、拟南芥Arabidopsisthaliana(NP_177979.1)等植物的相似度均达到80%以上,表明该蛋白序列与多种植物的TPS1的同源性较高。将其以FASTA 格式下载,利用DNAMAN 软件进行同源性比对,结果表明,穿心莲TPS1与其他植物TPS1均存在2个高度保守位点,即参与结合G6P底物的位点(Arg90、Trp129、Tyr166、Trp175 和 Arg397)和参与结合UDP-葡萄糖底物的位点(Gly111、Asp277、His251、Arg359、Asp458 和 Glu466)(图2),Asp458和 Glu466标志着糖原磷酸化酶糖基转移酶的保守区域(“1”和“2”)和糖原磷酸化酶糖基转移酶(Glycogen phosphorylase glycosyltransferase,GPGTF)家族共有的保守位点[41-42]。为进一步分析 ApTPS1蛋白与其他物种TPS1蛋白之间的关系,利用MEGA-X的邻近法构建ApTPS1的系统进化树(图3),结果显示穿心莲TPS1在进化上与凤梨TPS1亲缘关系最近,与芝麻TPS1亲缘关系也较近,而与拟南芥和烟草的TPS1的亲缘关系较远。

图2 穿心莲ApTPS1氨基酸序列与其他物种的TPS1氨基酸序列的多重比较Fig.2 Multiple alignments of amino acid sequence of ApTPS1 of Andrographis paniculata with TPS1s from other species

图3 不同植物的TPS1蛋白的系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree of TPS1 protein from different plants

2.3 ApTPS1蛋白二级结构和三级结构预测

ApTPS1蛋白二级结构预测显示(图4),该蛋白由33.41%的α-螺旋,49.03%的无规则卷曲和17.56%的β-折叠组成,无β-转角,无规则卷曲是其主要结构。利用SWISS-Model在线预测和同源建模穿心莲TPS1蛋白的三级结构(图5),结果表明, ApTPS1蛋白为同源二聚体,参考模板为α,α-trehalose-phosphate synthase 蛋白(PDB:5hut.1.A),两者氨基酸序列相似性达到50.33%。亚细胞定位预测分析该蛋白主要分布在细胞质中(52.25%),其次分布在细胞核中 (34.8%),再次为线粒体(8.7%)和囊泡(4.3%)。

绿色部分为 ApTPS1蛋白结构域中的糖原磷酸化酶糖基转移酶家族的活性位点;红色部分为11个重要的氨基酸The green parts are the active site of the glycogen phosphorylase glycosyltransferase family in the protein domain of ApTPS1;the red parts are 11 important amino acids图5 SWISS-Model模拟穿心莲 ApTPS1蛋白质三级结构Fig.5 Tertiary structure prediction of ApTPS1 from Andrographis paniculata by SWISS-Model

2.4 ApTPS1基因表达特征分析

2.4.1ApTPS1在穿心莲不同器官中的表达差异 穿心莲不同器官(老叶、新叶、花蕾、花、果实)中的ApTPS1基因的表达分析发现(图6-A),ApTPS1在开放的花中的表达量最高,其次为幼果,而在老叶、新叶和花蕾中的表达量较低且三者之间无显著差异。

A.穿心莲不同器官中 ApTPS1基因的差异表达;B.不同生态型穿心莲叶片 ApTPS1基因的差异表达,E1、E2均为早花型,L1、L2均为晚花型;C.不同光周期处理下穿心莲叶片 ApTPS1基因的差异表达分析,LD为长光照,SD为短光照,ND为中光照;采取Duncan’s法进行多重比较,图柱上不同字母表示在P<0.05水平差异显著A.Differential expression analysis of ApTPS1 gene in different organs; B.Differential expression analysis of ApTPS1 gene in leaves of different ecotypes,E1 and E2 are early-flowering materials,and L1 and L2 are late-flowering materials; C.Differential expression analysis of ApTPS1 gene in leaves under different photoperiod treatments,LD means long day,SD means short day and ND means normal day; The Duncan’s method was used for multiple comparisons.Different letters on the bars represent significantly different at the P<0.05 level图6 穿心莲 ApTPS1基因在不同器官、不同生态型及光周期处理下的差异表达Fig.6 Differential expression of ApTPS1 gene of Andrographis paniculata in different organs,different ecotypes and photoperiodic treatments

2.4.2 不同生态型穿心莲及光周期处理对ApTPS1基因表达的影响 利用RT-qPCR对不同生态型的穿心莲叶片ApTPS1进行差异表达分析,发现早花型穿心莲的ApTPS1基因表达量显著高于晚花型(图6-B)。通过不同光周期处理,分析穿心莲叶片ApTPS1的差异表达,如图6-C所示,早花型在各光周期条件下ApTPS1的表达水平均高于晚花型。不同光周期对晚花型穿心莲ApTPS1基因的表达没有显著影响,短光照(SD)下早花型的ApTPS1的表达量显著高于长光照(LD)。LD下晚花型植株叶片中ApTPS1基因表达量与早花型植株差异不显著,而在SD和中光照(ND)下晚花型植株叶片中ApTPS1的表达量显著低于早花型。

3 讨论与结论

T6P是植物调控开花的信号分子,其合成酶TPS1蛋白中有两个保守位点分别结合G6P底物和UDP-葡萄糖底物,可催化葡萄糖从UDP-葡萄糖转移到G6P生成T6P和UDP,进一步由海藻糖酶催化T6P生成海藻糖,是高等植物TPS-TPP生物合成途径的关键酶。本试验基于转录组数据首次从穿心莲中扩增得到 1 条编码区为 2 787 bp的TPS1基因全长序列,分析表明,穿心莲的TPS1氨基酸序列具有两个极度保守的位点:参与结合G6P底物的位点(Arg90、Trp129、Tyr166、Trp175 和 Arg397)和参与结合 UDP-葡萄糖底物的位点(Gly111、Asp277、His251、Arg359、Asp458 和 Glu466)。由于物种不同,这两个保守位点的各个活性氨基酸位置与拟南芥不同[41],其中,Asp458所在的RDGMNLVS区域和Glu466所在的EFVA区域共同标志着糖原磷酸化酶糖基转移酶的保守区域(“1”和“2”),同时第458位的Asp和第466位的Glu也被认为是糖原磷酸化酶糖基转移酶(Glycogen phosphorylase glycosyltransferase,GPGTF)家族共有的保守位点[41-42]。

植物从营养生长期到生殖生长期的转换受体内糖信号的调控[13-15]。外源施加蔗糖能促进拟南芥从叶期过渡到花期[4,17-23],且伴随着TPS1和TPPB基因的表达增强,表明海藻糖代谢途径的相关酶参与糖信号调控的植物开花[43]。许多研究表明,TPS1在植物胚胎发育和调控开花的过程中扮演至关重要的角色。拟南芥缺失TPS1不开花,且会导致植物形成胚胎致死型突变体,而过表达TPS1或tps1缺失突变体恢复表达TPS1使胚胎发育正常,但纯合子突变体植株即使恢复TPS1表达仍表现为生长缓慢,开花期延迟[1,12,24,29-30]。本研究结果表明,ApTPS1在穿心莲花中和幼果中的相对表达量较高,而在叶中的表达量较低,表明ApTPS1也可能参与穿心莲胚胎发育,且与拟南芥中的TPS1具有相似的功能。对不同开花期穿心莲进行比较发现,早花型ApTPS1的表达量远高于晚花型ApTPS1的表达量,进一步说明ApTPS1表达水平与穿心莲的开花期之间存在密切关系。有意思的是,对两个不同开花期材料进行光周期诱导,并未改变ApTPS1在材料之间的表达差异,而早花型材料在不同光照条件下的表达显著差异。结果说明,ApTPS1可能参与了植物自主开花的调控过程,与光周期诱导的开花通路相对独立。

开花期是许多药用植物有效成分积累的关键时期[31-34]。已有研究表明,随着生育期的变化,穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯类等有效成分的积累呈现出先上升后下降变化,在始花期含量最高[34,44]。此外,开花期较晚的穿心莲品种的生物量和内酯含量都较高[44]。ApTPS1作为与穿心莲开花期密切相关的因子,与穿心莲内酯成分的合成之间必然存在一定的联系。糖在促进药用植物次生代谢方面起到重要的作用[45],笔者前期研究也表明,糖和淀粉积累有利于穿心莲内酯的合成和积累[46-47]。ApTPS1是联系植物糖代谢与开花时间的重要枢纽,ApTPS1基因的克隆对深入研究穿心莲内酯合成与开花期的耦合关系,揭示穿心莲内酯合成的调控机制,并为其它植物的类似研究奠定良好的研究基础。ApTPS1因此也可以作为选育高内酯含量的穿心莲优良种质资源的候选基因,对后期筛选穿心莲优良品种的培育提供理论依据。