醋鸡内金配方颗粒的特征图谱建立及指标成分含量测定

刘天 张思琦 张志强 周永康 程立伟

【摘 要】 目的：建立醋雞内金配方颗粒特征图谱及指标成分含量测定方法。方法：采用ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；以甲醇-0.2%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱；体积流量为1.0 mL/min→0.5 mL/min→0.8 mL/min→1.0 mL/min→1.0 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长为254 nm。运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件对样品进行相似度评价，并确定共有峰。结果：建立的醋鸡内金配方颗粒的特征图谱及指标成分含量测定方法符合方法学验证要求。尿苷和鸟苷的进样量分别在0.0140～0.2799 μg、0.0106～0.2121 μg范围内有良好的线性关系。平均回收率分别为98.3%、103.1%。测定的7批醋鸡内金配方颗粒特征图谱相似度均>0.900，共标定了9个特征峰，并指认出其中4个成分，分别为：尿嘧啶、尿苷、腺苷和鸟苷。结论：该方法简便，准确，稳定性好，可用于醋鸡内金配方颗粒的质量控制。

【关键词】 醋鸡内金；配方颗粒；特征图谱；高效液相色谱法；质量控制

【中图分类号】   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）03-0023-05

Establishment of Characteristic Chromatogram Combined with Content Determination

of Target Components in Vinegar-Processed Gallus Gallus Domesticus Formula Granules

LIU Tianyi1，2，3 ZHANG Siqi1，2，3 ZHANG Zhiqiang1，2，3* ZHOU Yongkang1，2，3 CHENG Liwei1，2，3

1. Beijing Tcmages Pharmaceutical Co.， Ltd， Beijing 101301， China;

2.National and Local Joint Engineering Research Center for Key Technologies of Chinese

Medicinal Composition Granules， Tianjin 301700， China;

3.Beijing Engineering Technology Research Center for Chinese Medicinal Composition Granules， Beijing 101301， China

Abstract：Objective To establish a method for characteristic chromatogram and target components determination of Vinegar-processed Gallus gallus domesticus formula granules. Methods The determination was performed on Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column; the gradient elution solvent system was composed of methanol-0.2% phosphoric acid at the flow rate of 1.0 mL/min→0.5 mL/min→0.8 mL/min→1.0 mL/min→1.0 mL/min; the column temperature was set at 35 ℃， and detection wavelength was set at 254 nm. The Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to evaluate the similarity and to confirm common peaks.Results The validation results showed that the method could be used for characteristic chromatogram and target components determination of vinegar-processed Gallus gallus domesticus formula granules. Uridine and guanosine had a good linearity within the range of 0.0140-0.2799 μg， 0.0106-0.2121 μg， respectively．The average recovery of uridine and guanosine was 98.3%， 103.1%， respectively. Nine common peaks were identified with similarity more than 0.900 in 7 batches of vinegar-processed Gallus gallus domesticus formula granules， and four of those were identified as uracil， uridine， adenosine， guanosine.Conclusion This simple method has good repeatability and stability， which can be used for quality evaluation of Vinegar-processed Gallus gallus domesticus formula granules.

Keywords：Vinegar-Processed Gallus Gallus Domesticus; Formula Granules; Characteristic Chromatogram; HPLC; Quality Control

醋鸡内金为雉科动物家鸡Gallus gallus domesticus Brisson的干燥沙囊内壁，照清炒法（通则0213）炒至鼓起，喷醋，取出，干燥而得［1］。醋鸡内金作为鸡内金最常见的炮制品之一，在临床上应用广泛，具有健胃消食、固精止遗、活血通经等功效，常用于治疗小儿伤食、腹泻、遗尿、遗精、胆道结石及动脉粥样硬化等疾病［2-4］。醋炙能够使鸡内金质地酥脆，有利于粉碎及其有效成分的煎出，同时矫正了不良气味，使其更易于病人接受［5-7］。

醋鸡内金配方颗粒是以鸡内金药材为原料，经过水提、固液分离、浓缩、干燥、制粒等工序加工制成的供中医临床配方使用的颗粒剂。配方颗粒在使用过程中既能保持中医传统的君、臣、佐、使和辨证论治、灵活加减的特点，又免去了传统中药饮片煎煮的麻烦，更有利于患者服用［8］。醋鸡内金配方颗粒与鸡内金药材相比失去了固有的外观性状，因此在鉴别方面更加有难度。2020年版《中华人民共和国药典》中，鸡内金药材质量标准仅包括性状、检查（水分、总灰分）和浸出物检测项，对各主要成分的含量未做规定，无法实现对醋鸡内金配方颗粒质量的准确描述和评价［1］。要实现醋鸡内金配方颗粒的质量可控、稳定，完善其质量标准显得尤为重要。醋鸡内金配方颗粒化学成分复杂，目前未见到详细的文献报道揭示其具体有效成分，质量研究主要集中在其原料中蛋白质、多糖、酶、氨基酸等成分［9-13］，而对于醋鸡内金配方颗粒中核苷类成分的研究鲜有文献报道。核苷类成分是细胞的重要组成部分，对机体的免疫系统、代谢系统、内分泌系统及心血管系统具有很强的调节作用，能够增强机体免疫力，有益于小肠的生长发育、脂质代谢，还能够起到舒张血管、活化肝功能等药理作用［14-16］，与醋鸡内金配方颗粒发挥健胃消食、固精止遗、活血通经等功效具备一定关联性。醋鸡内金配方颗粒是以水为溶剂提取加工而成，而其水溶性成分主要是核苷类成分。日前，《上海市中药配方颗粒质量标准公示稿》公布了关于鸡内金配方颗粒的质量标准，该标准中以核苷类成分尿苷为指标控制产品质量，除此之外，以核苷类成分为指标的中药材相关质量标准目前已有广泛报道［17-21］。因此，本文将核苷类成分作为醋鸡内金配方颗粒质量控制的指标成分，并建立特征图谱，以期为醋鸡内金配方颗粒的质量标准进行补充。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters ACQUITY Arc型高效液相色谱仪（包括真空脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、TUV检测器；Empower色谱工作站，沃特世科技（上海）有限公司）；ML204T型电子天平（瑞士梅特勒·托利多公司）；XY2000-2C型电子天平（常州市幸运电子设备有限公司）；MSA6.6S-0CE-DM型电子天平（赛多利斯科技仪器（北京）有限公司）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；THZ-82型恒温水浴振荡器（金坛市精达仪器制造有限公司）等。

1.2 材料 尿苷（批号：110887-201803，纯度：99.5%），鸟苷（批号：111977-201501，纯度：93.6%），腺苷（批号：110879-201703，纯度：99.7%），尿嘧啶（批号：100469-201302，纯度：99.6%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。醋鸡内金配方颗粒S1～S7（批号：21007561、J2002390、18011561、21007021、21009061、20045321、20009221）由北京康仁堂药业有限公司提供，鸡内金药材（批号：202105-1-12）醋鸡内金饮片（批号：202104-4-10）经北京康仁堂药业有限公司于立伟老师鉴定为雉科动物家鸡Gallus gallus domesticus Brisson的干燥沙囊内壁，醋鸡内金饮片由炮制车间提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（250mm×4.6 mm，5 μm）。流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸水（B）。梯度洗脱0～13 min：0～5%甲醇，流速1.0～0.5 mL/min；13～15 min：5～10%甲醇，流速0.5～0.8 mL/min；15～55 min：10～60%甲醇，流速0.8～1.0 mL/min；55～60 min：60%甲醇，流速1.0 mL/min。检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 分别取尿苷、鸟苷、尿嘧啶和腺苷对照品适量，精密称定，加入蒸馏水分别制成每1 mL含6 μg尿苷、10 μg鸟苷、4 μg尿嘧啶和4 μg腺苷的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）40min，放冷，再次称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 特征图谱的建立

2.4.1 色谱峰指认 取上述對照品溶液及供试品溶液（批号：21007561）按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果如图1所示。结果显示，醋鸡内金配方颗粒供试品中色谱峰1、峰2、峰3、峰4分别与对照品溶液尿嘧啶、尿苷、腺苷、鸟苷色谱峰相对应。

2.4.2 精密度试验 取醋鸡内金配方颗粒（批号：21007561）0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以4号鸟苷色谱峰为参照峰（S），计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各特征峰相对保留时间的RSD为0.10%～1.30%，相对峰面积的RSD为0.99%～1.50%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取醋鸡内金配方颗粒（批号：21007561）6份，每份0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以4号鸟苷色谱峰为参照峰（S），计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各特征峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.02%，相对峰面积的RSD为0.15%～1.55%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取醋鸡内金配方颗粒（批号：21007561）供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，以4号鸟苷色谱峰为参照峰（S），计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各特征峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.02%，相对峰面积的RSD为0.26%～0.59%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.5 样品相似度评价 取7批醋鸡内金配方颗粒S1～S7，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色图谱。使用“中药色谱特征图谱相似度评价系统”（2012版），以S1图谱作为参照图谱，采用中位数对照谱图生成法，时间窗宽度设为0.1，生成醋鸡内金配方颗粒的对照图谱R，计算相似度评价结果。结果显示，建立的特征图谱共有9个特征峰，如图2所示。以4号鸟苷色谱峰为参照峰（S），计算7批醋鸡内金配方颗粒中各特征峰的相对保留时间，RSD为0.06%～1.04%，由此可见，建立的特征图谱各特征峰出峰时间较穩定。S1～S7批次醋鸡内金配方颗粒与对照图谱R的相似度分别为0.971、0.997、0.939、0.998、0.947、0.981、0.990，均大于0.900，符合特征图谱分析要求。

2.5 含量测定

2.5.1 线性关系考察 精密称取尿苷和鸟苷对照品7.033 mg和5.664 mg于250 mL容量瓶中，加入蒸馏水使溶解并定容至刻度得到混合对照品溶液⑤，精密吸取混合对照品溶液⑤0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得一系列不同浓度的混合对照品溶液①～④。将以上不同浓度的混合对照品溶液①～⑤按“2.1”项下色谱条件进样测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。见表1。

2.5.2 精密度试验 取6.32 μg/mL尿苷对照品溶液和9.37 μg/mL鸟苷对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，测定尿苷峰面积为：246592、247577、246890、246325、247330，鸟苷峰面积为：285958、286045、286458、287740、288153，计算尿苷峰面积RSD为0.21%（n=5），鸟苷峰面积RSD为0.35%（n=5），表明该系统的精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取醋鸡内金配方颗粒（批号：21007561）6份，每份0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得到尿苷和鸟苷平均含量分别为0.56 mg/g、0.45 mg/g，RSD分别为0.24%、0.31%，结果表明，该方法重复性较好。

2.5.4 稳定性试验 取醋鸡内金配方颗粒（批号：21007561）供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得到尿苷和鸟苷峰面积的RSD分别为0.19%和0.22%，结果表明，供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验 取醋鸡内金配方颗粒（批号：21007561）9份，每份0.25 g，精密称定，分别精密加入不同浓度的混合对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算平均加样回收率。结果见表2。

2.5.6 样品含量测定 取7批醋鸡内金配方颗粒（S1～S7），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得到尿苷平均含量分别为0.56 mg/g、0.50 mg/g、0.35 mg/g、0.49 mg/g、0.91 mg/g、0.52 mg/g、0.56 mg/g；鸟苷平均含量分别为0.45 mg/g、0.38 mg/g、0.36 mg/g、0.39 mg/g、0.85 mg/g、0.42 mg/g、0.64 mg/g。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 本实验考察了不同型号的色谱柱的分离效果，包括ZORBAX SB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Waters Xselect HSS T3（250 mm ×4.6 mm，5 μm）和Waters Symmetry C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）色谱柱，结果供试品在以上色谱柱上均能得到较好的分离，在ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱上峰形更优。

本实验比较了固定波长254 nm、360 nm和280 nm对色谱图的影响，结果显示，在254 nm波长下，特征图谱信息丰富，指标成分色谱峰响应值较高，且各特征峰之间分离度较好，基线较平稳。

本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水4种流动相系统，结果表明，当流动相为甲醇-0.2%磷酸水时，获得了更好的峰形，各色谱峰分布均匀。考察柱温（33 ℃、35 ℃、37 ℃）对色谱分离的影响，结果显示，该方法对不同柱温具有良好的耐用性。

3.2 供试品制备方法的考察 本实验对提取溶剂（蒸馏水、10%甲醇、30%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、10%乙醇、30%乙醇、70%乙醇和90%乙醇）进行比对，结果显示，以蒸馏水和10%甲醇作为提取溶剂时提取率较高，且各特征峰分离效果较好，从安全性和经济成本方面考虑选择蒸馏水为提取溶剂；对提取方式（振摇、超声和回流）进行考察，结果显示，三种方式均可将样品提取完全，且特征图谱无明显差异，从操作简便方面考虑选择超声为提取方式；最后对提取溶剂量（15 mL、25 mL、50 mL）和提取时间（20 min、40 min、60 min）进行考察，结果当提取溶剂量为50 mL，提取时间为40和60 min时均可将样品提取完全，从时间成本考虑选择提取溶剂量为50 mL，提取时间为40 min。

3.3 结果分析 本研究建立的醋鸡内金配方颗粒特征图谱信息丰富，标定共有峰9个，并准确指认出其中核苷类成分：尿苷、鸟苷、尿嘧啶和腺苷，有效提升了醋鸡内金配方颗粒特征图谱的信息量，充分反映了其水溶性成分的特征性。多批次醋鸡内金配方颗粒特征图谱相似度结果反映了醋鸡内金配方颗粒质量较为稳定，但是特征峰以外的其他色谱峰在不同批次间存在明显差异，后续可进一步研究产生差异性的成分及具体原因。与此同时，该方法可以同时实现对指标成分尿苷和鸟苷的含量测定，为更加全面控制醋鸡内金配方颗粒的质量提供参考。

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（收稿日期：2022-06-02 编辑：刘 斌）