基因治疗用于乳腺癌的研究现状

何祥宇 金荣仲

【摘要】 乳腺癌（breast cancer，BC）是女性最为常见的恶性肿瘤，也是全球女性癌症死亡的主要原因。手术、放疗和化疗等常规治疗的效果往往不如预期。基因治疗通过纠正缺陷基因和调节基因的表达来达到预期的治疗效果，目前已成为一种有前景的乳腺癌治疗策略。在乳腺癌的基因治疗中通常使用病毒载体和非病毒载体作为递送载体。病毒载体具有较高的转基因效率，但病毒载体存在免疫原性较高、具有插入突变的风险和生物安全性等问题。非病毒载体与病毒载体相比，细胞毒性、免疫原性和诱变性均较低。但它还需要解决基因转移效率较低、特异性不足、基因表达持续时间短等问题。本文综述了目前利用病毒载体和非病毒载体治疗乳腺癌的研究现状，这些基因治疗载体各有优缺点，因此本文对目前使用的基因治疗载体进行相关概述。

【关键词】 乳腺癌 基因治疗 病毒载体 非病毒载体

Current Status of Gene Therapy for Breast Cancer/HE Xiangyu， JIN Rongzhong. //Medical Innovation of China， 2023， 20（11）： -183

[Abstract] Breast cancer （BC） is the most common malignant tumor in women and the leading cause of cancer death in women worldwide. Conventional treatments like surgery， radiation and chemotherapy often don't work as well as expected. Gene therapy has become a promising strategy for breast cancer treatment by correcting defective genes and regulating gene expression to achieve the desired therapeutic effect. Viral and non-viral vectors are commonly used as delivery vectors in gene therapy of breast cancer. Viral vectors have high transgene efficiency， but there are some problems such as high immunogenicity， insertional mutation risk and biosafety of viral vectors. Non-viral vectors showed lower cytotoxicity， immunogenicity and mutagenicity than viral vectors. But it also needs to solve the low efficiency of gene transfer， lack of specificity， short duration of gene expression and other problems. This article reviews the current research status of the use of viral vectors and non-viral vectors in the treatment of breast cancer. These gene therapy vectors have their own advantages and disadvantages， so this article summarizes the current use of gene therapy vectors.

[Key words] Breast cancer Gene therapy Viral vectors Non-viral vectors

First-author's address： College of Intelligent Medicine and Biotechnology， Guilin Medical University， Guilin 541199， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.11.042

乳腺癌是絕经后妇女的主要死亡原因之一，占所有因癌症而死亡女性人数的23%[1]。目前乳腺癌的主要常规治疗方法包括手术治疗、化疗、放射治疗、激素治疗、免疫治疗。但是有多达1/3的乳腺肿瘤，对标准常规治疗会产生耐药或转移。所以引入基因治疗可以降低乳腺癌患者的死亡率，并提高患者的生活质量[2]。同时基因治疗还可以提高现有标准治疗的效果。

基因治疗指的是将遗传物质（DNA或RNA）转移到患者的细胞中，改变患者的基因以达到治疗、治愈或预防某种疾病或改善其健康状况的治疗[3]。转移的遗传物质通常通过以下三种方式之一来发挥作用：（1）外源基因能够表达并发挥功能。（2）抑制细胞自身靶基因的表达和功能。（3）修饰靶基因，改变细胞原有基因的功能。一般情况下，基因治疗需要载体将特定遗传物质递送到靶细胞中。基因载体可以是病毒载体或非病毒载体，他们在宿主体内保持活跃的时间，主要是取决于它们与宿主免疫系统等的相互作用和穿透所有屏障的能力，因此它们具有不同的免疫原性、表达水平和生物安全性。在基因治疗中这些基因载体是起到安全有效治疗的重要因素，因此需要慎重选择[4]。

1 病毒载体的基因治疗

病毒载体是将遗传物质有效递送到细胞中的工具。它们利用病毒的天然能力将有效遗传物质传递到细胞中，使肿瘤的复制能力受损或丧失。病毒载体具有较高的转基因效率，因此它们经常用于各类癌症的基因治疗中[5]。成功的病毒载体基因治疗的效果可以持续很多年，这样既可以减轻患者的疾病负担，又能大大提高患者的生存质量。尽管使用病毒载体的研究已经显示出相对有益的结果，但病毒载体的使用往往受到固有缺点的限制，包括免疫原性、插入突变、载量小和无法到达实体瘤。在此对已被用于基因治疗的五种病毒载体进行概述。

1.1 腺病毒载体 腺病毒载体（Ads）具有许多优点，因此是基因治疗中最常用的病毒载体之一。Ads是无包膜的并且具有双链DNA基因组的二十面体蛋白质衣壳（直径≥90 nm）。Ads的基因组DNA范围为26～45 kb，侧翼为两个反向末端重复序列（ITR）。腺病毒基因组在宿主细胞核中保持游离状态。Ads具有大包装尺寸，高达30 kb。Ads基因组作为附加体维持在细胞核中，因此使病毒基因组DNA整合到宿主基因组中的概率能够最小化，这降低了外源基因插入人类基因组进而诱发结构变异的风险。此外，Ads可以有效转导广泛的靶细胞，包括分裂的细胞和静止的细胞。

根据腺病毒载体在靶细胞中的复制能力，重组腺病毒载体可分为复制型和非复制型[6]。研究发现，通过瘤内注射编码白细胞介素-12（IL-12）的非复制型Ads与表达抗血管生成肽激素血管紧张素的Ads联合使用，可在乳腺癌小鼠模型中产生协同抗肿瘤作用[7]。有研究发现，Survivin是细胞凋亡抑制蛋白（IAP）家族的一员。Survivin的表达已被证明与癌症耐药性有关。紫杉醇是目前治疗乳腺癌最常用的化疗药物之一。然而，紫杉醇的获得性耐药是其最终化疗失败的重要原因之一。紫杉醇耐药的机制之一是凋亡调控蛋白Survivin的改变。研究人员使用携带针对Survivin的小干扰RNA（siRNA）的重组腺病毒载体来治疗乳腺癌，结果显示了特异性siRNA对Survivin的抑制，增强了紫杉醇诱导的乳腺癌细胞的凋亡[8]。Ads介导的基因治疗主要问题是该载体具有很强的免疫原性和全身给药的假定毒性，所以瘤内给药似乎是解决该问题的一个好方法。

1.2 单纯疱疹病毒载体 单纯疱疹病毒（HSV）是α-疱疹病毒亚家族的成员，该病毒含有120 kb的双链DNA基因组，编码70个或更多的基因。目前，lysotype HSV是第一个被开发成重组溶瘤病毒治疗载体的病毒，也是第一个对抗癌症的溶瘤病毒。HSV具有以下优点：（1）HSV在细胞中能够快速复制并具有感染多种癌细胞的能力。（2）HSV的基因组较大，可以修饰并插入多个额外的转基因[9]。（3）当剂量开始对患者的生命构成威胁时，可以使用抗病毒药物应对其产生的副作用[10]。（4）修饰HSV的糖蛋白可以改善对肿瘤细胞的靶向性[11]。

溶瘤单纯疱疹病毒（oHSV）载体已经被证明是一种安全有效的治疗乳腺癌的基因治疗载体[12]。oHSV病毒载体在肿瘤内通过选择性复制和病毒诱导，使细胞裂解并直接破坏肿瘤细胞。G47Δ是基于G207的第三代可复制HSV-1载体。该研究发现G47Δ可以有效杀死不同亚型的乳腺肿瘤细胞。G47Δ对人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-435和MDA-MB-468具有高度杀伤性，第4天时，超过98%的肿瘤细胞已经死亡，MOI为0.01。該研究还证明，G47Δ可以有效地靶向来自不同乳腺癌亚型的非癌干细胞（non-cancer stem cells，NCSCs）和癌症干细胞（cancer stem cells，CSCs），G47Δ还会损害CSCs的自我更新能力。G47Δ也表现出与紫杉醇的协同作用，可在体外和体内放大对NCSCs和CSCs的杀伤力[13]。

1.3 腺相关病毒载体 腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）也称为腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，复制时需要辅助病毒的参与。AAV于1965年被首次分离，虽然它不能自主复制，但AAV能够感染多种宿主细胞，包括分裂和不分裂细胞。感染后AAV基因组在宿主细胞中保持潜伏，在腺相关病毒整合位点（AAVS1）整合到宿主细胞的DNA中。AAV复制和感染需要辅助病毒，如Ads或HSV共感染。尽管AAV感染在人类中很常见，但目前没有证据证明该病毒可以直接引起特定的疾病。AAV在人体中是非致病性的，并且由于能够转导多种类型的细胞，因此AAV是基因治疗递送遗传内容的理想候选载体之一。AAV是很有潜力的治疗性基因传递载体，因为它能够转导广泛的组织，并以较低的免疫原性长期表达。这些优点和较好的安全性使它成为抗肿瘤基因治疗的理想载体之一。

已有研究表明，野生型AAV-2型的感染可诱导不同的乳腺癌细胞系进行凋亡，通过瘤内注射AAV-2到人MDA-MB-435乳腺肿瘤裸鼠移植瘤中可延缓肿瘤的生长并诱导肿瘤细胞坏死[14]。CH50是一种人纤连蛋白的重组CBD-HepⅡ多肽。研究发现用编码CH50的重组AAV-2载体来感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468并分泌可溶性的CH50。在两种乳腺癌细胞中，CH50通过干扰乳腺癌模型中的aVb3的信号传导来发挥其抗转移的作用。CH50对aVb3表达的下调抑制了乳腺癌细胞与ECM蛋白的黏附，进而抑制了FAK的激活、cdc2的上调及MMP-9的产生和激活。结果表明，重组腺相关病毒（rAAV）载体介导的CH50可以持续表达并抑制原位乳腺癌异种移植物的生长和自发转移。也就是说rAAV-CH50介导的基因转移可以抑制乳腺癌的早期肿瘤转移[15]。同时AAV也存在一些缺点，比如它的包装容量仅在5 kb以下，而且在某些细胞中的转导效率和特异性偏低。

1.4 逆转录病毒载体 逆转录病毒是基因转移的有效工具。它能够将遗传信息稳定地整合到宿主细胞染色体中。这种插入是通过逆转录将RNA基因组转化为双链的DNA[16]。在感染的细胞有丝分裂后，双链DNA可以整合到宿主基因组中并产生表达[17]。逆转录病毒分为两种：简单的逆转录病毒，如Moloney鼠白血病病毒和复杂的慢病毒（LVs），如人类免疫缺陷病毒（HIV）。简单的逆转录病毒只能感染活跃的分裂细胞，而LVs能感染分裂的细胞，也能感染未分裂的细胞[18]。这些载体能够进入到哺乳动物细胞并且长期稳定表达，使得它们成为基因治疗的理想候选载体。

慢病毒（LVs）已被用于转导外周血T细胞表达嵌合抗原受体（CAR）。该受体由肿瘤抗原特异性抗体与T细胞内信号域融合而成。然后将CAR-LVs转导的T细胞重新注射到宿主体内，以特异性靶向表达抗原的乳腺肿瘤细胞，如HER-2和MUC-1[19]，或FRα[20]。在一项研究中，皮下注射编码乳腺肿瘤抗原HER-2胞外区的LVs疫苗，可使携带自发性乳腺肿瘤的BALB/c-HER-2/Neu转基因小鼠产生抗肿瘤免疫[21]。LVs的多功能使其成为治疗转移性乳腺癌的免疫基因治疗的理想候选载体。虽然它的生产复杂并且滴度不高，但是因为它的低免疫原性和长期转基因表达等优点，使LVs成为癌症治疗的首选病毒载体之一。

1.5 新城疫病毒 新城疫病毒（NDV）是20世纪后期以来发现的首批溶瘤病毒之一[22]。NDV通过半胱天冬酶依赖性和半胱天冬酶非依赖性途径诱导细胞凋亡[23]。NDV又称禽副粘病毒1型（APMV-1），属于副粘病毒科的Avulavirus属。它是一种有包膜的单链RNA病毒，基因大小为16 kb。在肿瘤细胞中具有溶瘤活性，而在正常的人类细胞中不具有溶瘤活性。NDV作为抗癌剂的一些优点包括：（1）通过受体介导的内吞作用进入细胞，能够与细胞进行良好的结合。（2）在肿瘤细胞中进行选择性复制而且不依赖细胞的增殖。（3）没有严重的毒副作用[24]。

癌细胞通常需要大量的葡萄糖产生能量来支持它的代谢功能[25]。乳腺癌的干细胞具有发酵糖酵解依赖性，这使得它对糖酵解抑制剂较为敏感[26]。D-甘露庚酮糖（MH）是一种不可代谢的葡萄糖类似物，可以抑制己糖激酶，从而阻止癌细胞产生能量达到抗癌的作用[27]。研究结果表明，MH和NDV的组合可以通过抑制糖酵解途径和诱导细胞凋亡对乳腺癌细胞系产生有效的细胞毒作用，但对正常REF细胞系没有细胞毒作用[27]。新城疫病毒AF2240是一种速生毒株。经研究证明，新城疫病毒AF2240在体外以时间依赖的方式诱导MDA-MB-231细胞凋亡，而对内皮HUVEC细胞和Hs578Bst乳腺上皮细胞等正常细胞没有毒性[28]。然而，仍有待确定的是NDV可以表达多少转基因及它可耐受的最大基因组的大小。

2 非病毒载体的基因治疗

非病毒性载体与病毒载体相比，非病毒载体的细胞毒性、免疫原性和诱变性均较低，这些优点吸引了很多研究人员对其进行进一步的探索，从而推动了基因治疗领域的快速发展。但是非病毒载体用于基因治疗目前还存在较多的问题，它需要解决基因转移效率、特异性、基因表达持续时间和安全性等关键问题。非病毒载体需要保护遗传物质免受核酸内切酶的降解，并向细胞核进行转运和核摄取。而载体和细胞之间往往因治疗方式不同而产生不同的相互作用，這样会对转染的效率产生较大的影响。除效率之外，其毒性也不容忽视，免疫毒性则主要取决于具体的细胞和载体材料。但大多数非病毒基因载体的免疫毒性低于病毒载体，因此需要根据具体的情况对其进行评估。以下是用作基因治疗的三种非病毒载体类型。

2.1 聚酰胺胺（PAMAM）树枝状大分子 PAMAM树枝状大分子常用于药物和基因的递送。PAMAM树枝状大分子表面的正电荷降低了它的细胞毒性。PAMAM的特点如：高效的递送、特异靶向性、生物降解性、无毒性、非免疫原性和保护DNA免受降解的能力。PAMAM树枝状大分子为基因递送提供了一种有前景的载体[29]。与病毒输送载体相比，非病毒载体因其许多的优点而备受推崇[30]。但因其细胞的转染率较低，限制了它在临床上的应用。

Polo样激酶1是由Plk1基因编码的丝氨酸/苏氨酸激酶[31]。Plk1基因的活性在增殖的癌细胞中升高[32]。用抗Plk1 siRNA（siPlk1）抑制Plk1会导致有丝分裂停滞、细胞凋亡和抑制肿瘤生长[33]。然而siRNA的传递较困难，因为它们是带高负电荷的分子，因此它们不能轻易地穿过细胞膜。该研究使用应用于癌症治疗的PAMAM树枝状大分子的第4代（PG4）作为基因治疗载体。PG4与抗癌siRNA（siPlk1）复合形成siPlk1-PG4 dendriplex。PG4可以有效保护siPlk1免受核糖核酸酶（RNase）的影响，同时增强了siPlk1的血清稳定性。通过进行MCF-7细胞的体外抗癌活性研究表明，siPlk1-PG4可以导致细胞死亡。与裸siPlk1溶液相比，siPlk1-PG4导致MDA-MB-231细胞对siPlk1的摄取增强。通过细胞周期分析，与裸siPlk1溶液相比，siPlk1-PG4增加了亚G1期的细胞群停滞。结果表明，PG4可能是乳腺癌治疗中递送siPlk1的潜在载体[33]。

2.2 二硫交联聚乙烯亚胺（PEI-SS） PEI-SS是使用低分子量聚乙二醇（PEI）和二硫键为交联剂合成的。PEI-SS是一种谷胱甘肽反应性基因载体[34]，PEI-SS作为一种聚阳离子可以与miRNA结合生成PEI-SS/miRNA多聚体[35]。

微小核糖核酸MicroRNA（miRNA）是一种小的非编码RNA分子，约含有22个核苷酸。miRNA在基因表达的转录和转录后调控中起到关键的作用[36]。基因载体则帮助miRNA穿过细胞膜，并保护miRNA免受体核酸内切酶的降解[37]。目前，PEI-SS已被认为是传递DNA/miRNA的高效基因载体。

在一项研究中，PEI-SS首次被描述作为miRNA的非病毒载体。通过MTT测定PEI-SS对MDA-MB-231（人乳腺癌细胞系）的细胞毒性，显示PEI-SS具有较低的细胞毒性。PEI-SS能有效结合anti-miR-155，形成10～100 nm的纳米球形结构复合物。这种复合体被癌细胞中的还原剂谷胱甘肽（GSH）降解，然后释放出anti-miR-155并有效抑制肿瘤的生长。为了测试PEI-SS/anti-miR-155复合物的体内治疗效果，将3×105个MDA-MB-231细胞注射到裸鼠的乳腺脂肪垫中构建了异种移植肿瘤小鼠模型。在肿瘤生长期，发现与阴性对照相比，PEI-SS/anti-miR-155显著抑制了肿瘤的生长[34]。

2.3 无机纳米粒子（NPs） 研究人员发现，可以用NPs作为基因载体，因为它们显示出了优于传统有机载体的几个优点，分别是它们的尺寸较小，稳定性较高及易于合成[38]。金纳米颗粒（AuNPs）作为无机纳米粒子中的一种表现出了许多有利的特性，这有助于将其作为基因传递的载体[39]。siRNA能以静电结合的方式到阳离子聚合物包覆的AuNPs上，而且AuNPs的一个主要优势是它们的合成是可调的，允许合成不同的尺寸和形状。聚乙烯亚胺（PEI）修饰的AuNPs有助于在体外和体内的三阴型乳腺癌（TNBC）模型中有效地敲除真核细胞延伸因子激酶（EEF-2K）基因[40]。有报道用天然聚合物壳聚糖（CS）包裹的AuNPs成功地将c-myc siRNA导入MCF-7细胞。这些纳米复合体促进了MCF-7细胞中c-myc癌基因的显著下调[41]。Ahwazi等[42]使用包被HIV-1 TAT的AuNPs在MDA-MB-231细胞中敲除掉了ROR1基因。

介孔二氧化硅纳米粒子（MSNPs）也是一种无机纳米粒子，它含有直径为2～50 nm的孔，因其具有生物相容性、大孔径和高负载等能力，所以也是理想的候选载体[43-44]。PEI包被的介孔二氧化硅颗粒（MSNs）已被用于在体外和体内的MDA-MB-231模型中敲低PKM2基因，从而降低蛋白质的表达并抑制细胞的迁移[45]。研究人员还通过在中孔内利用MSNPs的多孔结构加载siRNA，从而防止核酸酶的降解。据报道，在MDA-MB-231模型中，使用具有23 nm大孔徑的MSNPs封装siRNA，可以使血管内皮生长因子（VEGF）基因在体外和体内得到了显著的下调[46]。

3 总结与展望

在过去的几十年中，基因治疗得到了迅速的发展。如今通过基因疗法治疗癌细胞，然后应用抗肿瘤的化学药物或放射疗法治疗可以达到肿瘤消退的效果。在乳腺癌的基因治疗中使用病毒载体和非病毒载体作为递送载体已经引起了人们的关注，并发挥出了一定的疗效。在基因治疗中，载体的作用十分关键，用于基因递送的最佳载体应表现出高效的负载能力，具有对特定靶细胞的趋向性，高效的转导性和较少的细胞毒性。在这篇综述中，讨论了病毒载体和非病毒载体的研究现状，其中病毒载体包括：腺病毒、HSV、腺相关病毒、逆转录病毒和NDV。非病毒载体包括：PAMAM树枝状大分子、PEI-SS和NPs。利用病毒载体或非病毒载体运送核酸作为治疗途径似乎是治疗乳腺癌的一种好策略。但是自从基因治疗问世以来，它的安全性和有效性一直是人们担心的问题。通常，人们认为病毒载体的效果更佳，但非病毒载体在大规模生产的简易性和较低的免疫原性等方面更具优势，继而开发出更加安全和高效的载体是非常必要的。将病毒载体与非病毒载体相结合，似乎是一种具有良好发展前景的基因治疗载体新技术，并且这种组合将利用两种方法的优势来绕过目前存在的障碍。

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（收稿日期：2022-10-21） （本文編辑：何玉勤）