马铃薯试管薯诱导培养基及诱导技术改良研究

许 杰，生兆平，夏印文

（1.山东省枣庄市农业科学研究院，山东枣庄 277800；2.山东省枣庄市山亭区北庄镇农业综合服务中心，山东枣庄 277218；3.山东省枣庄高新技术产业开发区兴仁街道办事处，山东枣庄 277800）

马铃薯种植范围广，鲁南地区是典型的马铃薯二季作区。枣庄市目前已发展成为全国最大、单产最高的二季作马铃薯代表性产区，截止到2021 年底，全市马铃薯栽培面积已发展到5 万hm2，总产值超过160 亿元[1]。

马铃薯连作障害导致病害发生严重，马铃薯本身容易产生各类病害问题，做好病害防治工作，确保产业推进是后续工作的重点和难点[2]。目前，解决马铃薯病害的主要方法是普及马铃薯脱毒种薯全覆盖，防止种薯带菌，随着马铃薯脱毒技术的引进和脱毒种薯的大量使用，马铃薯产业发展迅速，从而带动了马铃薯脱毒种薯技术的快速发展[3]。利用马铃薯脱毒试管薯播种在基质中繁育马铃薯脱毒原原种的方法优势明显，马铃薯苗成活率高，植株生长旺盛，而且，脱毒试管薯拥有种性好、体积小、质量轻、品质优、休眠期长、繁殖快的优点，同时，又为马铃薯种质资源的保存、交换、运输提供便利[4]。有关马铃薯脱毒试管薯诱导的研究报道中，张艳萍等[5]认为适合马铃薯试管薯诱导的培养基为MS 液体培养基或固液双层培养基。张天宇等[6]指出在8%蔗糖浓度下，液态+滤纸培养基与固态培养基对结薯率、薯块直径的影响差异不大。欧建龙等[7]报道适合试管薯诱导的培养基中蔗糖浓度为8%。杨莎等[8]试验表明含8%蔗糖的培养基试管薯诱导率远远高于含3%蔗糖的。本实验在前人研究成果的基础上以‘鲁引一号’为材料，改良了组培苗壮苗培养基配方和组培苗诱导试管薯的暗培养技术，以期找到提高试管薯产量和质量的最佳培养条件。

1 材料与方法

1.1 供试材料

马铃薯品种为‘鲁引一号’脱毒种薯，由山东省农业科学研究院提供。

活性炭，上海乐康活性炭有限公司。

蔗糖，食品级，苏州市邦卓精细化工有限公司。

椰子汁，海南椰树牌椰汁。

1.2 试验方法

基础培养基为MS 培养基，添加各种成分激素、蔗糖、活性炭、椰子汁等，加6 g/L 琼脂粉，分装组培瓶中，每瓶50 mL，高压灭菌锅中120 ℃湿热灭菌20 min，备用。

暗培养方式：组培苗经过壮苗培养，将组培瓶放入纸箱中，用覆盖透光率80%遮阳网进行暗培养。

1.2.1 马铃薯茎尖的剥离

用3 mg/L 赤霉素浸种8 min，将浸种后的马铃薯种薯沙培催芽，待芽长3 cm 左右，取出，冲洗干净备用。取芽尖1 cm 左右，自来水冲洗30 min，纱布擦干水，于超净工作台上，培养皿中75%酒精灭菌30s，0.1%升汞灭菌5min，无菌水冲洗5 次，无菌滤纸滤干水，解剖镜下进行茎尖剥离，取茎尖分生组织0.3 mm，放于灭菌过的培养基中进行马铃薯组培苗诱导[9]。

1.2.2 马铃薯脱毒苗的诱导

为兼顾马铃薯分生组织诱导组培苗的效果和成本，选择MS＋6-BA 2.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L 为马铃薯分生组织诱导组培苗的培养基配方。将茎尖分生组织放于灭过菌的培养基中于无菌培养室内培养，温度25 ℃，光照12h，光照强度2000 lx。诱导出马铃薯组培苗，待苗高5 cm以上时，可以进行马铃薯组培苗的病毒检测，经过病毒检测获得马铃薯脱毒苗[10]。

1.2.3 马铃薯脱毒苗的病毒检测

对组培苗进行病毒检测是培育脱毒苗的关键环节。目前，常用试剂条检测法。具体步骤为将要检测病毒的组培苗碾磨成汁液，将试剂条放入汁液中，检测是否有病毒，将带病毒的组培苗去除，经过筛选，获得脱毒组培苗备用[11]。

1.2.4 脱毒苗的快速繁育技术

无病毒的马铃薯组培苗可以用于大量繁育马铃薯脱毒苗。在无菌条件下，将待繁的脱毒苗一叶一节切段，扦插于1/2 MS 培养基中，3 d 以后，50%的切段萌根，5 d 以后全部生根，3～5 d 腋芽萌发，30 d 左右长成5～7 片叶的组培苗，可再进行循环繁殖[12]。

1.2.5 马铃薯脱毒组培苗壮苗培养

暗培养的植株，在遮光的条件下生长，不能进行光合作用，全靠试管苗本身储存的养分转化成小块茎。因此，壮苗培养是试管薯诱导的必要前提。将脱毒苗切去顶部和基部，把长到3～4 节的茎段放入液体培养基中培养，每瓶放入10 个茎段。常规液体壮苗培养基为MS+蔗糖30 g/L+活性炭5 g/L，改良壮苗培养基为MS 基础培养基，加入各蔗糖、椰子汁、活性炭配比，具体见表1。在组培瓶中作浅层液体静止培养。培养室的温度为25 ℃，每日光照16 h，光照强度在2 000 lx 以上，茎段培养5 d 即有腋芽萌出，30 d 瓶内长满小苗，即可转入暗培养诱导试管薯[13]。

表1 不同浓度原料对马铃薯组培苗壮苗培养的影响Table 1 Effects of different concentrations of raw materials on the strong seedling culture of potato tissue culture seedlings

1.2.6 壮苗暗培养诱导试管薯

将不同培养基培养出的马铃薯脱毒壮苗，进行暗培养，常规方法是一直暗培养60 d，然后收获马铃薯试管薯。改良后暗培养方法是将马铃薯脱毒壮苗暗培养10 d，散射光培养10 d，然后继续暗培养，直到60 d 收获[14]。

1.3 主要观察记载项目

不同壮苗培养基，培养马铃薯30 d 后，利用游标卡尺测量马铃薯组培苗的茎粗，以毫米为计量单位；利用拍照式叶面积仪测量叶面积，以平方毫米为单位，取平均值比较。

暗培养30 d 后，记录每瓶诱导出的试管薯数量，以个为计量单位；暗培养60 d 后收获，记录试管薯单薯平均质量，以毫克为计量单位。单薯质量增减变化计算公式见式（1）。

1.4 仪器

YMJ-P1 拍照式叶面积仪，山东恒美电子科技有限公司；标康SL01-1 高精度电子数显游标卡尺。

1.5 统计方法

用Excel 2010 版本进行数据分析和处理。

2 结果与分析

2.1 马铃薯脱毒组培苗壮苗培养结果

由表1 可知，增加活性炭、蔗糖、椰子汁的量，可以较明显增加马铃薯组培苗的茎粗及叶面积，培养基配方MS+活性炭15 g/L+蔗糖100 g/L+椰子汁100 mL/L 培养的马铃薯组培苗平均茎粗最粗、平均叶面积最大，茎粗达到2.1 mm，平均叶面积达到46 mm2，较常规培养基配方MS+蔗糖30 g/L+活性炭5 g/L 培养的马铃薯组培苗茎粗增加75%，叶面积增加84%。其它培养基配方培养的马铃薯组培苗较常规培养基配方培养的组培苗在组培苗茎粗和叶面积上均有明显增加，培养基配方MS+活性炭10 g/L+蔗糖50 g/L+椰子汁100 mL/L 培养的马铃薯组培苗，茎粗为1.7 mm，叶面积为40 mm2，较常规培养基配方培养的马铃薯组培苗茎粗增加了42%，叶面积增加了60%。

综合成本及实际应用效果，最终选择MS+活性炭10 g/L+蔗糖50 g/L+椰子汁100 mL/L 培养基配方进行壮苗培养。

2.2 马铃薯脱毒组培苗壮苗暗培养诱导试管薯结果

由表2 可知，改良暗培养方式及改良配方，可明显增加马铃薯试管薯平均单株结薯个数和平均单薯质量，平均单薯质量与常规方式差异极显著，改良暗培养方式比常规培养方式诱导的试管薯平均单株结薯个数增加35.8%，改良培养基配方较常规培养基配方诱导的试管薯平均单株结薯个数增加27.3%；改良暗培养方式比常规培养方式诱导的试管薯平均单薯质量增加9.3%，改良培养基配方较常规培养基配方诱导的试管薯平均单薯质量增加10.9%。因此，暗培养方式改良后大幅度增加了马铃薯试管薯单株结薯个数，而培养基配方的改良可以有效增加马铃薯试管薯单薯质量。

表2 不同的暗培养方式对马铃薯试管薯的影响Table 2 Effects of different dark culture methods on potatoes in vitro

3 小结

试验将常规培养基配方MS+蔗糖30g/L+活性炭5g/L改良为MS+活性炭10 g/L+蔗糖50 g/L+椰子汁100 mL/L，将常规的一直暗培养方式改良为暗培养10 d，散射光培养10 d，然后再暗培养。试验结果表明，改良后马铃薯试管薯平均单株结薯4.2 个，比常规培养增加35.8%，改良后马铃薯试管薯平均单薯质量319 mg，比常规培养增加10.9%。

马铃薯种薯繁育时，由于地块、环境、蚜虫的影响，致使脱毒种薯退化严重，由于脱毒品种检测手段、检测标准普及率低，致使部分马铃薯种子质量较差，给农民带来巨大的经济损失。因而，选用高质量的脱毒种薯用于大田生产以及保持脱毒微型薯种性不退化是提高马铃薯产量水平的最简捷、快速的有效途径。而试管薯体积小，无病原，储藏、运输方便，并克服了试管苗移栽成活率差，以及剪尖扦插易污染等一系列的问题，对于加速脱毒种薯在生产上的应用非常有利，但是，利用组培苗进行试管薯诱导难度较大，产量也不高，试管薯个头小，播种后成活率有一定的影响[15]。

下一步，本课题组将会继续改进马铃薯试管薯诱导培养基及诱导方法，并试验利用500 mL 组培瓶进行马铃薯小微型薯组培瓶内生产，即在500 mL 组培瓶内放入栽培基质，如蛭石等，然后将马铃薯组培苗切段栽插在组培瓶内，在基质中生产小微型薯，用以提供成活率和质量。