基于网络药理学探讨益气补肺颗粒对肺癌的免疫调节机制

戴菲菲 孔红武 谢柏胜

[摘要] 目的 利用網络药理学方法探讨益气补肺颗粒对肺癌的免疫调节机制。方法 应用中药系统药理学数据库分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、公共化合物数据库（PubChem）、药物靶点预测数据库（Swiss Target Prediction）及人类基因数据库（the Human Gene Database，GenCards）分别获得药物成分、药物潜在靶点和肺癌相关靶点，将二者交集靶点通过String数据平台进行药物–疾病蛋白质互作网络构建，进而利用Cytoscape软件筛选出关键药物成分和核心靶点。通过Webgestalt数据平台进行基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析；运用AutoDock进行分子对接。结果 益气补肺颗粒含有潜在活性成分129个，主要成分包括3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、豆甾醇。调节肺癌相关免疫功能的潜在靶点137个，核心靶点主要有信号转导及转录激活蛋白3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（rac-alpha serine/ threonine-protein kinase，AKT1）、酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase，TPK）、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase3，MAPK3）、热休克蛋白90α家族A类成员1[heat shock protein 90-kDa alpha（cytosolic），class A member 1，HSP90AA1]。GO富集分析结果显示核心靶点主要与炎症反应、免疫系统调节、蛋白质磷酸化等有关；KEGG信号通路主要包括C型凝集素受体（c-type lectin receptor，CLR）信号通路、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路、Th17细胞分化等。分子对接结果显示5个关键成分与5个核心靶点均有较好的结合活性。结论 益气补肺颗粒可通过甘草、天冬、当归、人参中的多种活性成分、多靶点作用，并通过影响CLR信号通路、VEGF信号通路、Th17细胞分化等多通路起到提高肺癌患者免疫功能的作用。

[关键词] 肺癌；免疫功能；益气补肺颗粒；网络药理学；分子对接

[中图分类号] R285      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.15.014

Study on the immunomodulatory mechanism of Yiqi Bufei granule on lung cancer based on network pharmacology

DAI Feifei， KONG Hongwu， XIE Baisheng

Department of Cardiothoracic Surgery， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310007， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of Yiqi Bufei granule in regulating immune function of lung cancer by network pharmacology. Methods Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP）， PubChem， Swiss Target Prediction and the human gene database （GenCards） were used to obtain drug components， potential drug targets and lung cancer related targets， respectively. The intersection targets of the two were used to construct drug-disease protein interaction network through String data platform. CytoScape software was used to screen out key drug components and core targets. Gene ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Eencyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway analysis were analyzed by Webgestalt data platform. Molecular docking was performed using AutoDock. Results Yiqi Bufei granule contained 129 potential active ingredients， included 3-methoxy-glabridin， glycyrol， phaseol， 7-methoxy-2-methyl isoflavone， and stigmasterol. There were 137 potential targets for regulating lung cancer-related immune function， and the core targets mainly included signal transduction and activator of transcription 3 （STAT3）， proteinkinase （AKT1）， tyrosine protein kinase（TPK）， mitogen-activated protein kinase3 （MAPK3） and heat shock protein 90-kDa alpha （cytosolic）， class A member 1 （HSP90AA1）. GO enrichment analysis showed that the core targets were mainly related to inflammatory response， immune system regulation， protein phosphorylation， etc. KEGG pathway mainly included c-type lectin receptor （CLR） signaling pathway， vascular endothelial growth factor （VEGF） signaling pathway， Th17 cell differentiation and so on. The results of molecular docking showed that the five key components had good binding activities with the five core targets. Conclusion Yiqi Bufei granule may have multiple active ingredients and targets in licorice， tiandong， angelica， ginseng， and may also improve the immune function of lung cancer patients by affecting multiple pathways such as CLR signaling pathway， VEGF signaling pathway， and Th17 cell differentiation.

[Key words] Lung cancer; Immune function; Yiqi Bufei granule; Network pharmacology; Molecular docking

肺癌是一种由遗传和表观遗传畸变驱动的疾病，在所有恶性肿瘤中，肺癌发病率和病死率位居前二[1-2]。传统化疗和放疗可产生多种不良反应，如器官功能受损、肿瘤细胞转移、耐药及相关免疫功能下降[3-4]。中医认为治疗肺癌应祛除邪毒，与现代医学抑制肿瘤细胞增殖、调控细胞凋亡和转移的治疗策略一致。研究显示，中医药对细胞免疫和体液免疫具有良好的调节作用，对减轻肺癌患者不良反应和提高生存质量有显著效果[5-6]。中药成分可通过不同途径改变机体免疫功能，如槲皮素通过调节细胞间信号，有效控制肿瘤细胞的数量[7]。研究结果表明益气补肺颗粒对肺癌患者免疫功能有良好的改善作用，国内外研究均证实益气补肺颗粒中的中药成分黄芪、当归、人参、天冬、五味子、甘草对肺癌治疗有一定疗效[6，8-12]。中藥成分复杂，其药理作用可通过不同途径产生免疫调节作用，但目前有关益气补肺颗粒对肺癌免疫调节机制的研究较少。本研究在先前研究的基础上，通过网络药理学和分子对接探讨益气补肺颗粒对肺癌患者免疫功能的调节机制，确定药物的有效活性成分、作用靶点和关键通路，为临床试验及新药研发提供理论依据。

1  资料与方法

1.1  益气补肺颗粒有效活性成分及靶点获取

益气补肺颗粒由黄芪、当归、人参、天冬、五味子、甘草组成。利用中药系统药理学数据库分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）对上述6种中药的活性成分进行筛选，以药物生物利用度≥30%、类药性≥0.18为标准。通过公共化合物数据库（PubChem）收集成分中化合物的结构式，进而利用药物靶点预测数据库（Swiss Target Prediction）进行靶点预测，获得药物有效活性成分对应的靶点，最后删除重复靶点，得到药物作用靶点。

1.2  肺癌免疫功能靶点收集

通过人类基因数据库（the Human Gene Database，GenCards）搜索“lung cancer”和“immunity”，得到肺癌、免疫功能相关靶点，筛选标准以相关度值（relevance score）>8倍中位数值。

1.3  益气补肺颗粒调节肺癌免疫功能作用靶点及网络构建

将上述益气补肺颗粒调节肺癌免疫功能的中药及其有效活性成分、靶点的数据通过Cytoscape软件，构建药物–活性成分–靶点网络，并计算各个中心度值、节点度值，筛选核心活性成分。

1.4  构建蛋白质-蛋白质相互作用网络

将益气补肺颗粒和肺癌的交集靶点导入String数据平台，蛋白质参数设置为“multiple proteins”，物种参数设置为“Homo sapiens”，交互评分最小值设置为0.7，隐藏离散靶点，构建蛋白质–蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。下载PPI文件并导入Cytoscape软件进行拓扑参数分析，分析结果包括中心度值、节点度值，用于核心靶点筛选。

1.5  GO富集分析和KEGG通路富集分析

利用Webgestalt数据平台对益气补肺颗粒和肺癌交集靶点进行基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路分析，以P<0.05为标准获得有差异的生物过程、细胞组分、分子功能及信号通路信息。

1.6  分子对接

从TCMSP数据平台下载核心活性成分的3D结构作为分子对接的配体小分子；使用AutoDock软件进行分子对接，结果由Open Babel软件进行格式转换，最后通过PyMOL软件进行可视化处理。

2  结果

2.1  益气补肺颗粒活性成分及作用靶点

筛选得到158个活性成分，其中黄芪20个、当归2个、人参22个、天冬9个、五味子13个、甘草92个，去除重复项后得到129个有效活性成分，其中共有活性成分11个。Swiss Target Prediction靶点预测分别得到黄芪690个、当归115个、人参611个、天冬326个、五味子497个、甘草965个，删除作用靶点中的重复项，最终获得1239个益气补肺颗粒活性成分对应的靶点，见表1。

2.2  益气补肺颗粒-肺癌-免疫功能相关靶点

通过GenCards获取肺癌基因和免疫功能基因，筛选后获得肺癌相关基因1319个，免疫功能基因1081个，药物–疾病–免疫功能交集靶点137个。

2.3  药物-活性成分-靶点-疾病网络构建

有效活性成分、作用靶点及对应的药物数据网络构建显示，共有272个节点，包括6个药物节点、129个化合物节点和137个交集靶点节点，2917条交互作用关系，见表2。节点度值排名前5的活性成分分别为3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、豆甾醇。

2.4  蛋白质互作网络构建与分析

利用Cytoscape软件绘制PPI网络图，共有137个节点、1546条互作关系，通过CytoHubba插件计算获得节点中心度值、节点度值。根据节点度值进行排序，前20为核心网络，其中前5名分别为信号转导及转录激活蛋白3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（rac-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase，TPK）、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase3，MAPK3）、热休克蛋白90α家族A类成员1（heat shock protein 90-kDa alpha（cytosolic），class A member 1，HSP90AA1）。

2.5  GO富集分析和KEGG通路富集分析

GO富集分析获得生物过程1923条、细胞组成103条及分子功能168条。按照校正P<0.01筛选，将排名前20的条目进行气泡图绘制。益气补肺颗粒对肺癌免疫调节的生物过程主要为炎症反应、激活免疫反应、免疫系统正向调节、对外部刺激反应调节、白细胞活化；细胞成分主要与膜筏、膜微区、受体复合物、质膜外侧、囊泡腔、胞质囊泡腔等密切相关；分子功能涉及STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1等。

KEGG富集分析共得到187个信号通路，以P<0.05筛选排名前20的通路绘制富集条形图，如C型凝集素受体（c-type lectin receptor，CLR）信号通路、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路、Th17细胞分化、缺氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1）信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路等，见图1。

2.6  分子对接

结合能<–5kal/mol表明蛋白分子与配体小分子有较好的结合能力，本研究筛选5种关键成分与5个核心靶点的分子对接见表3。选择中心度值最高的STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1与5种关键活性成分构建的分子对接模式见图2。

3  讨论

本研究结果表明，益气补肺颗粒对肺癌免疫调节的主要有效活性成分为3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、豆甾醇，主要存在于甘草、天冬、当归、人参4味中药。同时发现潜在靶点137个，通过PPI网络图可知STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1是肺癌免疫调节的核心靶点。

益气补肺颗粒组方中的黄芪、甘草、人参属补益类中药，所含多种黄酮类、酚类和查尔酮类可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，增加机体免疫功能；天冬、当归所含活性成分具有润肺止咳、养血补血的作用[9]。全方奏补脾益肺、养阴润燥、补血活血之效。研究结果发现，益气补肺颗粒中的活性成分-3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、豆甾醇在肺癌免疫调节中发挥关键作用。3-甲氧基光甘草定、甘草酚属异黄酮类化合物，是甘草的主要成分，通过增强巨噬细胞的吞噬能力、

抑制肿瘤细胞增殖，促进抗癌先天免疫和适应性免疫反应[13-15]。Lu等[16]发现健脾复方配方中，菜豆醇是主要活性成分之一，可通过调节β-连环蛋白传导相关基因和蛋白抑制肿瘤细胞的生长和转移。研究发现，7-甲氧基-2-甲基异黄酮可通过下调白细胞介素-6基因表达水平发挥抗炎和免疫调节作用[17]，与本研究结果类似。豆甾醇可通过调控MAPK3蛋白表达、雌激素信号通路、甲状腺激素信号通路發挥抗炎作用[18]。

STAT3、AKT1、TPK是肺癌组织的标志物，是肺癌靶向治疗的关键靶点。本研究分析表明，STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1是调节肺癌免疫功能的关键靶点，与前述结果基本一致[19-24]。通过抑制TPK表达可阻断AKT信号通路，而AKT1是P13K/AKT、PERK/eIF2α信号通路的枢纽，进而诱导肺癌细胞凋亡，抑制肺癌的发展[19-21]。MAPK3是细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulatedkinase，ERK）家族的一员，参与调节细胞增殖、分化和生长周期[22]。作为一种伴侣蛋白，HSP90AA1敲低可抑制AKT1和ERK激活，从而促进肺癌细胞凋亡，并抑制肺癌细胞增殖[23]。

KEGG分析结果显示，益气补肺颗粒主要通过CLR信号通路、VEGF信号通路、Th17细胞分化、HIF-1信号通路、PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路发挥免疫调节作用。其中CLR信号通路肿瘤免疫调节发挥重要作用，激活CLR可增强免疫细胞的吞噬作用，有效提高机体免疫系统功能[24]；VEGF信号通路在血管生成过程中发挥不可替代的作用；Mu等[25]发现钙调蛋白2（calmodulin2，CALM2）通过调控VEGF等信号通路，增强巨噬细胞极化，进而促进肿瘤组织血管内皮细胞的增殖、迁移；Th17细胞对机体免疫反应和宿主防御至关重要，通过分泌白细胞介素-17对抗细胞外的细菌及霉菌[26-28]。

综上，本研究利用网络药理学方法探讨益气补肺颗粒对肺癌的免疫调节机制，确定药物关键成分为3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮和豆甾醇，可通过CLR信号通路、VEGF信号通路、Th17细胞分化、HIF-1信号通路、PI3K/AKT信号通路等作用于STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1等靶点发挥免疫调节作用。

[参考文献][1] SCHABATH M B， COTE M L. Cancer progress and priorities： Lung cancer[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2019， 28（10）： 1563–1579.

[12] ZHAO L N， YANG Y Q， WANG W W， et al. The effects of traditional Chinese medicine combined with chemotherapy on immune function and quality of life in patients with non-small cell lung cancer： A protocol for systematic review and Meta-analysis[J]. Medicine （Baltimore）， 2020， 99（45）： e22859.

[22] DROSTEN M， BARBACID M. Targeting the MAPK pathway in KRAS-driven tumors[J]. Cancer Cell， 2020， 37（4）： 543–550.