IL-10调控HaCaT细胞增殖及分化的分子机制

尹雪莉,贾 波,刘 莉,李明聪,张 军,杨 振,白红枚,胡伟康,张素梅,张胜权

人白细胞介素(interleukin, IL)-10属于II类IL-10家族细胞因子,细胞因子家族包括IL-19、IL-20、IL-28A、IL-28B以及 IL-29等。IL-10由Th2细胞分泌,抑制Th1细胞分泌细胞因子[1]。其基因定位于1号染色体(1q32.1),编码17～20 ku糖蛋白[1-2]。IL-10受体由α、β两个亚单位组成,广泛表达于多种组织、细胞,包括皮肤角质形成细胞[3]。IL-10通过与其受体激活JAK-STAT、PI3K、MAPK等信号途径调节免疫功能,主要表现为抑制IL-1α、 IL-1β、 IL-6、 IL-8、 IL-12、 IL-18、 IL-23、TNF-α等炎症因子表达[4]。研究[5]表明IL-10与许多疾病的发生发展有关,包括银屑病。银屑病是炎症性皮肤疾病,以皮肤角质形成细胞过度增殖及分化不全为特征,目前认为其发病机制是细胞免疫介导的自身免疫性疾病;免疫细胞及皮肤角质形成细胞分泌的促炎症因子,包括TNF-α、IL-17和IL-22,促进皮肤角质形成细胞过度增殖及抑制分化。而IL-10能抑制这些促炎因子的分泌,理论上是潜在的银屑病治疗的靶点[5]。在银屑病皮损中,IFN-γ和TNF-α呈现高表达,而Th2细胞分泌IL-4和IL-10因子相对表达不足[6];此外,研究[7-8]显示,IL-10启动子区域的多态性与银屑病的发病相关,但IL-10在皮肤组织中的作用仍不十分清楚。该研究主要探讨IL-10对皮肤角质形成细胞的增殖及分化等影响,初步揭示IL-10在银屑病发病中可能的作用。

1 材料与方法

1.1 材料DMEM 高糖培养基、胎牛血清(美国 Gibco 公司);0.25%胰酶、青-链霉素溶液、细胞周期试剂盒(上海碧云天生物技术公司); IL-10 (美国Peprotech 公司);AKT、磷酸化 AKT (pAKT)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、磷酸化ERK1 /2 (pERK1/2)(美国 Sant Cruz 公司); PD98059 、LY294002(美国 Sigma公司); TRIzol、SYBR Green 染料、RT-qPCR 扩增试剂盒(日本 TaKaRa 公司); Real-time 引物(上海生工生物工程技术服务有限公司);MTS试剂盒(美国Promega公司);HaCaT 永生化角质细胞为本实验室保存。

1.2 引物从数据库National Center for Biotechnology Information (nih.gov) 检索获得相关基因序列,Premier 7.0 设计引物,引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

1.3 方法

1.3.1细胞培养 将对数期HaCaT 细胞0.25%胰酶消化接种于6孔板中,用含 5% 胎牛血清,1% 双抗DMEM高糖培养基,在 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.3.2MTS检测细胞增殖 将对数期HaCaT 细胞0.25%胰酶消化计数每孔接种5 000个细胞于96孔板中,以0、3、10、30 ng/ml浓度的IL-10处理HaCaT细胞,分别在时间点(0、24、48、72 h)每孔加入20 μl MTS,孵育30 min后,置于酶标仪中检测450 nm处吸光度值。

1.3.3流式细胞仪分析细胞周期 将对数期HaCaT 细胞用0.25%胰酶消化接种于6孔板中, 10 ng/ml的IL-10处理HaCaT细胞24、48 h,依据细胞周期试剂盒说明书,分别收集细胞;细胞固定:加入1 ml冰浴预冷70%乙醇中,轻轻吹打混匀,4 ℃固定30 min预冷PBS洗2次;每管细胞加入500 μl碘化丙啶(PI)染色,常温避光30 min,流式细胞仪上机检测。

1.3.4RT-qPCR检测K1、K5、Involucrin mRNA水平表达 HaCaT细胞接种12孔板,次日换液;特异性抑制剂(PD98059 70 μmol/L LY294002,32 μmol/L)培养1 h, 然后加入IL-10 (10 ng/ml) 培养1 h,加入1.2 mmol/L CaCl2继续培养12 h,TRIzol 提取细胞总RNA,逆转录后得到cDNA,以此为模板,按照 TaKaRa 公司的说明书配好反应体系。预变性:95 ℃、30 s,循环1次;PCR反应:95 ℃、5 s,60 ℃、20 s, 循环40次。数据根据2-ΔΔCt法进行统计处理。

1.3.5Western blot 分析相关蛋白水平 用不同浓度的IL-10处理HaCaT细胞, 提取总蛋白,蛋白定量后,加入蛋白上样缓冲液,100 ℃,煮沸5 min。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白; 将蛋白转移至PVDF膜; 5% 脱脂奶粉4 ℃封闭过夜; 一抗pERK1 /2(1 ∶500)和 pAKT(1 ∶500)及Actin(1 ∶1 000), 4 ℃过夜; TBST 洗膜 3 次,每次10 min;山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)室温孵育 2 h; TBST 洗膜 3 次,每次10 min;滤纸吸干,涂ECL 发光剂,曝光、拍照、Image J 图像软件分析各目的蛋白水平变化。

2 结果

2.1 IL-10对HaCaT细胞增殖的影响为了探讨IL-10是否体外影响HaCaT细胞增殖,以图中所示浓度及时间用IL-10处理HaCaT细胞,结果显示在以0、3、10、30 ng/ml的IL-10处理的HaCaT分别与同时间点(0、24、48、72 h)的对照组(0 ng/ml, IL-10)相比其细胞增殖未见显著性差异(P>0.05)。见图1。

图1 MTS分析IL-10对HaCaT细胞增殖调控结果(n=6)

2.2 IL-10对HaCaT细胞周期的影响为了进一步验证IL-10对HaCaT细胞增殖的影响,该实验以10 ng/ml的IL-10处理HaCaT细24、48 h, PI染色后,流式细胞仪检测IL-10对HaCaT细胞周期的影响。如图2所示,IL-10处理HaCaT细胞24和48 h,与对照组(0 ng/ml)相比,10 ng/ml IL-10处理的HaCaT,其细胞各期(G1、S、G2)细胞数量百分比未见显著性差异,提示IL-10对HaCaT细胞周期无显著性影响。

图2 流式细胞术分析IL-10对HaCaT细胞周期的调控(n=3)

2.3 IL-10上调CaCl2诱导的HaCaT细胞分化标志物INV的表达为了探究IL-10对HaCaT细胞分化的影响,加入IL-10(终浓度10 ng/ml)处理HaCaT 1 h后,加入或不加CaCl2,终浓度为1.2 mmol/L,继续培养24、48、72 h,Western blot检测HaCaT角质形成细胞的分化标志物(K1表达于颗粒层;K5表达于基底层;Involucrin表达于棘层),IL-10(10 ng/ml)能够协同CaCl2诱导的HaCaT角质形成细胞分化标志物Involucrin的表达,如图3所示,单独IL-10处理24 h内对Involucrin没有显著影响,单独CaCl2处理24 h上调Involucrin的表达,而IL-10处理48及72 h,IL-10可以诱导Involucrin表达,且与CaCl2有协同效应。IL-10单独处理HaCaT细胞24 h,上调K5差异有统计学意义(P<0.05),但48、72 h表达水平略有降低,而对K1表现为抑制。

图3 IL-10上调经CaCl2诱导的HaCaT角质形成细胞分化标志物(n=3)

2.4 IL-10通过PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2途径调控HaCaT角质形成细胞分化的作用为了探讨IL-10调控HaCaT细胞分化标志蛋白分子表达的分子机制,IL-10(10 ng/ml)刺激HaCaT细胞不同时间, Western blot分析IL-10是否激活 PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2途径,与对照组(相同培养条件未加IL-10), IL-10分别在15和30 min开始显著增加pAKT及pERK1/2的水平,分别在45和120 min达到峰值,而对总AKT及ERK1/2没有显著性影响,提示IL-10能够激活PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2。同时特异性抑制剂PD98059(MAPK抑制剂)或LY294002(AKT抑制剂)能够阻断IL-10对PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2途径的激活效应。见图4。

图4 IL-10诱导AKT及ERK1/2磷酸化(n=3)

2.5 特异性抑制剂预处理后IL-10对HaCaT角质形成细胞分化的影响IL-10能够激活PI3K-AKT和MAPKs-ERK1/2信号途径,为了探讨IL-10促进HaCaT细胞分化蛋白表达是否依赖其激活该2条信号途径,以特异性抑制剂 (PD98059或LY294002) IL-10(10 ng/ml)单独或联合处理HaCaT细胞12 h,RT-qPCR 检测分化标志物的mRNA水平相对表达,Western blot检测分化蛋白标志物表达,抑制剂及IL-10同样处理48 h,分析分化标志物的蛋白水平表达。结果显示PD98059能够显著抑制IL-10单独或与CaCl2联合诱导的Involucrin及K1 mRNA和蛋白质水平表达,PD98059对CaCl2单独诱导的Involucrin、K1及K5表达没有显著影响,PD98059单独处理也显著抑制Involucrin、K1及K5 mRNA及蛋白水平表达;LY294002则对各组均显著抑制(图5)。

图5 特异性抑制剂检测IL-10对HaCaT角质形成细胞分化影响(n=3)

3 讨论

IL-10是一种多功能细胞因子,调控多种细胞的生物学行为,包括免疫及上皮细胞。该研究表明IL-10能上调HaCaT角质形成细分化标志物Involucrin,表现出与钙离子的协同效应,其可能的机制是IL-10部分通过MAPKs-ERK1/2和PI3K-AKT信号途径发挥其上调CaCl2诱导HaCaT角质细胞分化的作用。

IL-10具有免疫抑制作用的多功能免疫调节因子,如抑制树突细胞炎症因子的生成及抗原递呈作用,然而IL-10表现出促进CD8+T细胞的细胞毒活性,因此,IL-10如何发挥其作用可能与周围的微环境相关[1-2,5],研究[9]表明IL-10受体广泛表达于多种细胞,包括皮肤角质形成细胞。银屑病主要以皮肤角质形成细胞过度增殖和分化不全为特征[10]。本研究显示IL-10体外不影响人皮肤角质形成细胞HaCaT细胞的增殖,但是促进HaCaT细胞分化标志物的表达,提示其抑制银屑病发病的机制不仅由于其抑制免疫细胞分泌炎症细胞因子,可能还直接作用于皮肤角质形成细胞发挥促分化作用。研究[11-12]表明IL-10在银屑病皮损中低表达,临床试验显示银屑病皮损局部注射IL-10能够缓解银屑病的症状。因此,IL-10是否通过促进皮肤角质形成细胞分化改善银屑病症状还有待于进一步研究。

该研究表明IL-10能够激活HaCaT细胞的PI3K-AKT及MAPK信号途径,并且其促进HaCaT细胞的分化部分依赖MAPK及PI3K-AKT途径。研究[13-14]表明MAPK-ERK及PI3K-AKT激活能够促进皮肤角质形成细胞的分化,这与IL-10激活MAPK-ERK及PI3K-AKT进而促进HaCaT分化结果一致。研究[15-16]表明ERK 信号途径 和 PI3K信号途径参与了人皮肤角质形成细胞增殖与分化的调节,ERK1/2激活诱导KCs细胞分化,而PI3K激活维持分化KCs的存活,从而使得皮肤角质形成细胞在增殖与分化之间达到平衡。 此外,IL-10还能激活JAK-STAT细胞途径[1-2],提示IL-10对HaCaT细胞增殖及分化的影响机制可能涉及多条信号途径,是多条信号途径激活后的综合效应,有待进一步研究。