EGFR基因突变与肺腺癌脑转移相关性研究

周 静,胡冰琪,黄俊峰,刘 宇,王南楠,陈礼文

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种跨膜酪氨酸激酶受体,介导对细胞增殖、分化和生长至关重要的信号,其突变激活与肺腺癌的发生和进展有关[1-2]。中国肺腺癌患者中,EGFR突变率高达45%～55%。常见的EGFR突变有EGFR19缺失(19 Del)及21点突变(21 L858R),这两种突变在所有EGFR突变中约占50%和40%[3]。目前中国临床肿瘤协会推荐EGFR突变的肺腺癌患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)作为一线治疗药物。但肺腺癌EGFR基因突变及其靶向药物治疗与脑转移的相关性尚不明确。该研究通过分析初诊以及EGFR-TKIs靶向治疗后EGFR基因突变肺腺癌患者脑转移比例,结合体外EGFR-TKIs敏感性实验对相关差异进行机制探讨。

1 材料与方法

1.1 病例资料回顾性收集2018年1月—2022年3月在安徽医科大学第二附属医院就诊的肺腺癌患者病例资料。纳入标准:① 经病理学确诊为肺腺癌;② 所有患者均进行基因检测;③ 所有患者均通过MRI、CT检查明确是否脑转移。剔除标准:① 其他部位的原发肿瘤;② 临床资料不完整。该研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 实验材料人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞系H3255(21 L858R)购自上海富衡细胞库;PC9(19 Del)购自北京沃比森科技有限公司;吉非替尼(Gefitinib)(10 mg/支)(货号SML1657)购自美国Sigma-Aldrich公司;RPMI-1640及DMEM培养基购自上海源培生物科技股份公司;胎牛血清购自南京维森特生物科技有限公司;CCK-8试剂盒购自北京兰杰柯科技有限公司;青-链霉素混合溶液、胰酶购自上海碧云天生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1药物配制 将Gefitinib溶于DMSO中,形成10 mmol/L的原液于-80 ℃ 冰箱保存备用,同时将原液分别稀释为0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 μmol/L。实验中各组DMSO溶剂均浓度不超过0.1%。

1.3.2细胞培养 将细胞H3255、PC9分别用RPMI-1640及高糖DMEM完全培养基中培养,培养基内含10%胎牛血清、1%双抗(50 U/ml青霉素和0.05 mg/ml链霉素)。并将细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱培养后传代。

1.3.3CCK-8法测Gefitinib对细胞的半抑制浓度IC50取对数生长期细胞,以每孔5×103个细胞,100 μl细胞悬液接种于96孔板,每组设置3个复孔,培养24 h后,分别加入100 μl不同浓度的Gefitinib溶液,培养箱中孵育72 h后加入含有10% CCK-8的完全培养基溶液,再次放入培养箱孵育1 h后,酶标仪在波长450 nm处检测各孔吸光度值(OD)。

2 结果

2.1 患者一般临床资料的分析该研究共纳入肺腺癌患者410例,年龄24～92(63±11)岁。其中在发生脑转移的患者中,年龄≤60岁有69例(43.4%),年龄>60岁患者84例(33.5%),二者差异有统计学意义(χ2=4.103,P=0.043);淋巴结N2～3与淋巴结N0～1的患者分别为135例(39.7%),18例(25.7%),两者差异有统计学意义(χ2=5.511,P=0.028);而脑转移发生率在性别、吸烟史、原发病灶大小及原发病灶T之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 410例肺腺癌患者临床特征 [n(%)]

2.2 EGFR突变与患者脑转移的相关性410例患者中发生EGFR突变(19 Del/21 L858R)222例,EGFR野生型188例,两者发生脑转移分别为85例(38.3%)和68例(36.1%),差异无统计学意义(χ2=0.195,P=0.695)。EGFR突变和野生型腺癌患者在肝、骨、胸膜、肾上腺等转移比率之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 EGFR基因突变与肺腺癌远处转移相关性分析[n(%)]

2.3 EGFR突变亚型与肺腺癌脑转移的相关性104例EGFR 19 Del患者中,发生脑转移31例(29.8%);118例EGFR 21 L858R患者中,发生脑转移54例(45.8%),两者差异有统计学意义(χ2=5.965,P=0.015)。EGFR 19 Del和21 L858R患者发生肝、骨、胸膜、肾上腺等部位转移比例差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。将年龄、EGFR突变亚型、淋巴结等脑转移影响因素进行多因素分析显示,EGFR 21 L858R(OR=2.393;CI=1.335～4.291;P=0.003),年龄≤60岁(OR=1.884;CI=1.054～3.376;P=0.033)及淋巴结转移N2～3(OR=3.429;CI=1.444～8.143;P=0.005)是肺腺癌脑转移的危险因素(图1)。

图1 影响肺腺癌脑转移发生的Logistic回归分析

表3 EGFR突变亚型与肺腺癌常见远处转移相关性 [n(%)]

2.4 EGFR基因与脑转移病灶相关性EGFR突变型和野生型肺腺癌患者中,多发性脑转移灶(>3个)患者分别为45例(53%)和17例(25%)(χ2=12.237,P<0.001)。EGFR突变亚型中,19 Del和21 L858R患者脑转移病灶呈多发灶(>3个)分别有11例(34.4%)和34例(64.2%),两者差异有统计学意义(χ2=7.101,P=0.008),提示EGFR突变型尤其是EGFR 21 L858R更倾向于多发病灶性转移。见表4。

表4 EGFR基因突变与脑转移病灶相关性分析[n(%)]

2.5 EGFR基因型与初诊脑转移相关性分析在初诊脑转移患者中,EGFR野生型与突变型发病比例分别为18.6%(35/188)和21.6%(48/222),差异无统计学意义(χ2=0.569,P=0.451)。EGFR突变亚型中,19 Del和21 L858R的患者脑转移比例分别为13.5%(14/104)和28.8%(34/118),差异有统计学意义(χ2=7.688,P=0.006)。见表5。

表5 EGFR基因型与初诊脑转移相关性分析[n(%)]

2.6 EGFR-TKIs靶向治疗后脑转移时间分析EGFR突变的患者接受EGFR-TKIs靶向治疗后,分别有17例19 Del和20例21 L858R患者进展为脑转移,其脑转移中位数时间(月)分别为15(8.50, 25.00)和7(4.25, 12.25),两者差异有统计学意义(P=0.013),提示21 L858R患者接受EGFR-TKIs靶向治疗后脑转移时间显著短于19 Del患者(图2)。

图2 EGFR基因突变患者靶向治疗后脑转移时间

2.7 Gefitinib抑制肺腺癌PC9、H3255细胞的增殖为探讨EGFR-TKIs靶向治疗后21 L858R更易发生脑转移的相关机制,该研究采用梯度浓度的Gefitinib处理肺腺癌H3255(21 L858R)和PC9(19 Del)细胞72 h,CCK-8法检测细胞存活率并计算IC50值。相比Gefitinib未处理组细胞,Gefitinib以浓度依赖方式抑制H3255和PC9细胞增殖。计算H3255和PC9细胞的IC50分别为(0.150±0.040)和(0.037±0.008) μmol/L(P=0.007),提示携带19 Del的PC9细胞比H3255(21 L858R)细胞对Gefitinib更敏感。见图3。

图3 不同浓度Gefitinib处理2种肺腺癌细胞的生存能力及IC50

3 讨论

该研究对410例肺腺癌患者的分析表明,年龄≤60岁和淋巴结N2～3分期是脑转移高危因素。这与Ji et al[4]及吴炳群 等[5]研究结果一致,Ji et al[4]研究表明年龄≤60岁、非鳞状细胞癌患者更易发生脑转移;吴炳群 等[5]研究也表明年龄≤60岁和N分期越晚的NSCLC患者更易发生远处转移。因此,该研究揭示了肺腺癌脑转移患者的临床特征,同时提示在临床工作中需重点关注符合此特征的患者,提前预防治疗。该研究表明初诊的EGFR 21 L858R患者较19 Del更易发生脑转移,但EGFR野生型及突变型患者脑转移比例无显著差异,提示21 L858R也是肺腺癌脑转移的一个危险因素。Enomoto et al[6]研究也表明EGFR野生型与突变型肺腺癌患者脑转移发生率无显著差异,但Wang et al[7]研究表明EGFR突变的晚期非鳞状细胞肺癌患者脑转移累积发病率显著高于非突变患者,提示在突变类型的患者中需重点关注21 L858R患者。同时在临床工作中可以依据该研究的3个独立危险因素,对患者脑转移风险进行评估及预测。该研究表明,在EGFR野生型与突变型之间以及21 L858R与19 Del之间其他远端转移包括骨、肝、肾上腺和胸膜转移无显著差异。而Doebele et al[8]表明EGFR突变的NSCLC患者倾向肝转移,不倾向骨、肾上腺、脑等远处转移。上述研究结果与该研究不一致的原因可能是由于病例资料选择的不同所致,该研究仅纳入肺腺癌中晚期患者,而该研究纳入标准是所有非小细胞肺癌患者。

该研究对EGFR突变亚型与脑转移发生率关系进行分析显示,在222例EGFR突变的患者中21 L858R的患者比19 Del更易发生脑转移,但是对于其他远处病灶的转移无明显差异性。唐珊珊 等[9]研究表明21 L858R患者较19 Del更易发生脑转移,研究结果与该研究基本一致。为探讨此种差异形成的原因,该研究采用梯度浓度的Gefitinib处理肺腺癌H3255(21 L858R)和PC9(19 Del)细胞72 h,研究表明PC9细胞对Gefitinib的IC50显著低于H3255细胞,提示PC9细胞对Gefitinib的敏感性高于H3255细胞。该研究推测治疗后21 L858R的患者容易出现脑转移的原因可能是不同突变对靶向药物治疗的药物疗效不同所致。该研究通过临床数据及细胞实验提示在临床工作中应该个体化治疗,精准的打击癌症,从而实现最佳医学治疗效果,使患者生存期得到最大延长。目前已有研究[10-11]表明2个突变亚型对EGFR-TKIs治疗敏感性不一致,19 Del对EGFR-TKIs敏感性更好,有更长的无进展生存时间、总生存期和良好的治疗反应。另外,该研究考虑EGFR-TKIs治疗后脑转移发病率可能受回顾性研究时间横断面的影响,导致患者观察时间不一致,造成一定的误差,因此,该研究暂未比较治疗后脑转移发病率。

该研究表明,肺腺癌EGFR突变患者多发性脑转移灶(>3个)发生率显著高于野生型患者;在EGFR突变亚型中,21 L858R较19 Del患者更易出现多发(>3个)脑转移病灶,提示EGFR突变尤其是EGFR 21 L858R倾向于多发病灶性脑转移。研究结果与Enomoto et al[6]和Shin et al[12]基本一致,但前者观察21 L858R与19 Del脑转移灶的中位数分别为9.5(5～14)和12(1～12)(括号内为病灶数目范围),差异无统计学意义。可以看出21 L858R和19 Del患者的最少转移灶分别为5和1个,而该研究以3个为界限值,这可能是导致研究结果差异的原因。该研究表明肺腺癌EGFR突变与脑转移病灶数目的相关性。

综上所述,年龄≤60岁、淋巴结N2～3分期以及EGFR 21 L858R突变是肺腺癌患者发生脑转移的高危因素。21 L858R突变患者接受EGFR-TKIs靶向治疗后进展为脑转移的中位时间显著短于19 Del,可能与二者对靶向药物的敏感性有关。该研究为肺腺癌患者脑转移的风险预测及个体化靶向治疗提供临床依据。