38例ABO血型抗原表达异常的基因分析*

杨红梅,陈敏洁,邹 昕,虞 茜,马思飞,张建伟

江苏省常州市中心血站/常州市临床输血重点专科实验室,江苏常州 213004

ABO血型系统是输血医学中最重要的一个血型系统,在临床输血、器官移植和产前诊断中具有重要意义[1-2]。正确的血型鉴定是临床输血安全的重要保障。在ABO血型血清学鉴定时常常因正反不一致、抗原表达减弱、抗体减弱或消失及混合视野等现象导致定型困难,出现疑似亚型。目前国内对于ABO亚型的研究报道多见于个案[3-6],本研究对38例血清学检测抗原异常表达的血型标本进行ABO基因第1～7外显子编码区测序,探讨ABO血型抗原表达减弱的分子机制及常州地区基因多态性。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019年1月至2021年12月来自常州市各医疗机构及本站检测中心血清学鉴定正反不一致送输血研究室进行疑难血型鉴定标本38例,其中献血者11例(微孔板法),患者27例(凝胶卡法)。血样于静脉采集5 mL,4 ℃保存于EDTA抗凝管中。本研究已通过常州市中心血站医学伦理委员会审查(20230102)。

1.2仪器与试剂 AB公司9700型PCR扩增仪、DNA浓度测定仪、凝胶成像系统、贝克曼高速离心机、久保田KA-2200血清学专用离心机、37 ℃恒温水浴箱。抗-A/B单克隆抗体(上海血液生物)、抗-D(IgM)单克隆抗体(上海血液生物)、抗-H抗体(德国CE)、抗-AB抗体(德国CE)、抗-A1抗体(上海血液生物)、ABO血型反定型红细胞(北京金豪)、抗体筛选细胞(匈牙利REAGENS)、ABO-特异性序列引物聚合酶链反应(PCR-SSP)基因分型试剂盒(天津秀鹏生物)、DNA提取试剂(Invitrogen)、琼脂糖(北京沃比森)、溴化乙锭(10 mg/mL,捷世康)。

1.3方法

1.3.1血清学检测 采用盐水试管法对38例标本进行ABO血型血清学鉴定。取被检者和对照A、B、O型献血者红细胞少许,生理盐水洗涤3次,均配制成2%～4%红细胞生理盐水悬液进行抗-H、抗-A1和抗-AB试验,离心判读凝集强度;同时对标本进行抗体筛查。所有试验均严格按照AABB技术手册第18版[7]和文献[8]方法及试剂操作说明书进行。

1.3.2PCR-SSP基因组DNA提取及ABO基因扩增、电泳跑胶后的胶图比对分析 使用Invitrogen DNA提取试剂盒提取患者外周血基因组DNA,调整DNA模板水平为30～35 ng/μL,A260/A280比值为1.60～1.80,根据人类ABO血型基因检测试剂盒说明书设置参数进行PCR扩增。取扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳跑胶、生成凝胶成像图谱,与天津秀鹏生物试剂盒提供的图谱进行比对。

1.3.3ABO基因测序分析和序列比对 ABO基因第6～7外显子扩增片段大小约为2 019 bp,扩增反应体系参照天津秀鹏生物试剂盒说明书,上游引物为5′-CCTGCCAGCTCCATGTGAC-3′,下游引物为5′-CAGGACGGACAAAGGA-3′。扩增产物经纯化后测序第1～7外显子编码区,该实验部分委托天津秀鹏生物完成。第6外显子测序上游和下游引物为5′-CATGTGGGTGGCACCCTGCC-3′,5′-ATGTCCACAGTCACTCGCCA-3′;第7外显子上游和下游引物:5′-GCTCCCCCAGCCCCCGTCCG-3′,5′-GTTTACCCGTTCTGCTAA-3′。测序后与NCBI在线数据库nucleotide blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对,确定其基因型。

2 结 果

2.1血清学检测结果 对38例标本采用盐水试管法进行ABO血型鉴定,血清学结果显示ABO血型抗原表达异常,正反定型结果不符,抗体筛选试验均为阴性。其中A抗原表达异常14例,B抗原表达异常24例,其中与抗-A或抗-B试剂反应呈混合视野18例,标本红细胞与抗-H试剂均有不同程度反应,38例标本经血清学鉴定均为ABO亚型,涉及血清学表型包括Bend、cisAB/A、ABx、B(A)、cisAB/O、ABend、AxB、Bx、Bmh、Aend、B3、AB3、A3、Am共14种。对照A、B、O型红细胞与抗-H、抗-A1和抗-AB反应结果均符合传统规律。由于38例标本ABO抗原检测基本上均有明显凝集,因此没有再进行红细胞吸收放散试验。

2.2分子生物学检测结果 ABO血型基因第1～7外显子编码区测序结果根据ISBT(International Society of Blood Transfusion)网站提供的Names for ABO(ISBT001)blood group alleles v1.1171023综合结果判定(以ABO*A1.01为参考序列)。38例标本结果分布为7例A亚型、11例B亚型及20例AB亚型。38例标本中共检出ABO等位基因18个,其中常见的等位基因15个,罕见的等位基因1个(Bw30/O01)及新等位基因2个。常州地区ABO基因多态性主要以A102/B101、A307/O02及Bw03为主,其中A102/B101占18.4%(7/38)、A307/O02占15.8%(6/38)、Bw03占7.9%(3/38)。例1、8、12、13、17因突变未被ISBT网站收录。见表1和图1。

注:a为A102(873C>T);b为A102/Bw.03(1036A>C);c为B310/O01(28G>A)。

3 讨 论

ABO基因位于第9号染色体,由7个外显子组成,共编码354个氨基酸。ABO等位基因编码区发生突变时可引起ABO基因编码物质的改变,从而导致ABO亚型产生。目前研究ABO亚型主要有血清学水平(血液免疫学实验)、基因水平(DNA、mRNA)、蛋白水平(氨基酸、糖基转移酶、蛋白)3种模式[9-10]。因ABO基因77%的编码系列位于第6和第7外显子,本研究对38例血清学检测ABO血型抗原表达异常标本第1～7外显子编码区进行测序分析,进一步阐述ABO血型亚型的分子生物学机制。

根据ISBT等位基因命名表,目前已确认300多种ABO等位基因。本研究结果表明,常州地区B亚型多于A亚型,与章旭等[11]的调查结果基本一致。本研究PCR-SSP法采用天津秀鹏生物试剂盒,该试剂盒根据中国人群常见ABO亚型设计,适用于我国采供血机构ABO血型基因分型的常规筛查。在38例标本中发现3例为突变型组合未收录和2例新突变位点,这5例标本由西安浩瑞基因技术有限公司负责单倍体分型。结果表明,例1为突变型组合未收录,其碱基突变有28G>A、261delG、297A>G、526C>G、657C>T、703G>A、796C>A、803G>C、903G>A,在单倍体2中出现了错义突变28G>A,该突变位于第1号外显子最后一个碱基处,它不仅改变了氨基酸种类,还有可能造成外显子剪接错误。该突变虽未被ISBT收录,但上海市血液中心蔡晓红团队已将序列提交到国际血型抗原基因突变数据库,并在文章中首次报道28G>A错义突变[12];但当时未对28G>A导致B3表型的机制展开研究。2017年蔡晓红团队继续对该突变进行功能性研究,探讨是剪接性能影响还是氨基酸改变,因此对含有该突变的单倍体cDNA采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应进行表达量评估,证实了28G>A突变会对剪接功能造成影响[13]。例8为突变型组合未收录,其碱基突变有297A>G、467C>T、526C>G、657C>T、703G>A、796C>A、803G>C、838C>T、903G>A,在其中一条单倍体中发现了838C>T错义突变引起p.Leu>Phe的改变;结合其他突变位点推测其为较罕见的Ax24,同时可上报ISBT申请新分型单倍体。例13为突变型组合未收录,其碱基突变有297A>G、526C>G、657C>T、703G>A、761C>T、796C>A、803G>C、930G>A、261delG,在正常B1的格局中发生761C>T错义突变;该突变型组合未被ISBT收录,结合其他突变位点推测其为较罕见的BW30。

此外本研究还发现2例新突变位点,均并未被ISBT收录(正提交NCBI命名中)。例12在A102/O01的基础上第7外显子发生了 1036A>C 的杂合突变。根据血清学结果推断,该突变应位于A基因上的B单倍体发生了1036A>C错义突变;血清学表型为Bw03。例17在A102纯合的基础上其第7外显子第873号碱基发生了C>T的杂合突变并对其进行单倍体检测,在单倍体2中发现了未被报道过的873C>T同义突变,该突变未造成氨基酸改变;从密码子使用频率来看,天门冬氨酸Asp的GAT使用频率相对较低,因此推测该突变可能会对蛋白合成速度的造成影响;预测表型为A102,该突变点并未被NCBI数据库收录,可上报ISBT申请新基因。

综上所述,本研究通过本地区献血人群38例血清学检测ABO血型抗原表达异常标本的基因多态性,初步了解其分布特征。当出现ABO抗原弱表达或ABO正反定型不符现象时,建议将血型基因分型技术与血型血清学技术结合运用,以防止血型分型判断错误。我国为多民族国家,不同地域、不同民族人群的血型基因多态性存在差异,有条件的地区应建立本区域血型基因多态性数据库,为精准输血治疗及输血医学发展提供样本来源及理论基础。