防治甜瓜细菌性果斑病种传病原菌的杀菌剂筛选

林 涛,马国斌,姜守阳,张克岩,李菊芬*

(1 上海市农业科学院设施园艺研究所,上海市设施园艺技术重点实验室,上海 201106;2 上海农科种子种苗有限公司,上海 201106)

细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,简称BFB)是由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenaesubsp.citrulli)引起的一种多发于葫芦科作物的世界性病害[ 1],也是我国植物检疫性病害之一。 在高温高湿环境下,病原菌可快速繁殖,导致作物在苗期烂苗毁苗[ 2],果实膨大期主要侵染叶片和果实,使其失去商品价值,造成减产,严重危害我国西瓜、甜瓜及其他葫芦科作物的生产[ 3]。 由于细菌性果斑病是典型的种传病害,且其病原菌具有存活时间长、抗逆、抗干旱、抗衰老、致病力强等特点[ 4-6],因此对带菌种子进行灭菌处理,控制和消除病害的最初侵染来源是防治该病害的关键。

目前,种子发酵[ 7]、高温干燥处理[ 8-9]、药剂处理[ 10-12]等方法均可不同程度地杀灭种子所携带的细菌性果斑病菌。 由于药剂处理方便快捷、效果显著,因此种子处理的方法多以药剂处理为主。 目前,关于甜瓜带菌种子的药剂处理虽已有报道,但存在药剂更新慢、研究结果不一致等问题[ 13-14]。 本研究选用16 种杀菌剂进行带菌种子处理试验,以期建立一套更安全、更高效的甜瓜带菌种子的处理方法,为甜瓜细菌性果斑病的防治提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试甜瓜种子:在新疆繁育的携带瓜类细菌性果斑病菌的甜瓜种子。

供试菌株:由中国农业科学院郑州果树研究所提供的细菌性果斑病标准菌株(Acidovoras avenae

subsp.citrulli)。

供试杀菌剂:共16 种,参考推荐使用剂量,每种杀菌剂选择3 个稀释倍数,使用无菌水稀释,现配现用(表1)。

表1 供试杀菌剂Table 1 The tested bactericides

1.2 方法

1.2.1 混菌平板的制作

将培养48 h 的供试菌株配制成108CFU∕mL 的菌悬液,按体积比1∶20 的比例将菌悬液和40 ℃的LB培养基(琼脂粉用量为15 g∕L)混合均匀,倒板(平板直径9 cm)后于超净台内吹干备用[ 15]。

1.2.2 杀菌剂抑菌效果的测定

采用抑菌环法。 将直径为6 mm 的灭菌滤纸片置于含菌平板上,每皿3 片,等边三角形放置。 分别取配制好的杀菌剂5 μL 滴于滤纸片上,于超净台内吹干,28 ℃下倒置培养48 h 后,用十字交叉法测量抑菌环直径[ 15],以无菌水处理为对照,每个处理重复3 皿。 菌落生长抑菌率=[(处理抑菌环直径-对照抑菌环直径)∕处理抑菌环直径 ] ×100%[ 16]。

1.2.3 种子的杀菌剂处理和PCR 检测

称取完整带菌种子10 g,放入灭菌三角瓶中,加入50 mL 配制好的杀菌剂,分别处理30 min、60 min和90 min 后用流水冲洗3 次,再加入10 mL 无菌水,于28 ℃、220 r∕min 摇培4 h,取1 μL 摇培提取液作为PCR 模板,进行PCR 检测。 以带菌种子加入10 mL 无菌水进行摇培作为对照(CK),各处理设置3 个重复。

选用特异引物BX-L1:5’-CAGCTGGGAGCGATCTTCAT-3’ 和BX-S-R2:5’-GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3’进行PCR 扩增[ 17]。 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR 所需试剂均购于天根生化科技(北京)有限公司。 PCR 反应体系(25 μL):10 × buffer 2.5 μL,MgCl22 mmol∕L,dNTPs 0.2 mmol∕L,Taq DNA 聚合酶1 U,正反向引物各0.2 μmol∕L,模板1 μL,无菌三蒸水补齐。 扩增条件:95 ℃3 min;94 ℃35 s,60 ℃35 s,72 ℃45 s,35 个循环;72 ℃7 min。 PCR 仪为BIO-Rad T100TM Thermal Cycler。 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳和Goldview 染液染色后,于紫外凝胶成像系统(Tanon 3500)下观察并拍照[ 18]。

1.2.4 病原菌存活检测

半选择性KB 培养基的配制参照李菊芬等[ 9]:蛋白胨20 g∕L,丙三醇10 mL∕L,MgSO4·7H2O 1.5 g∕L,K2HPO41.5 g∕L,琼脂15 g∕L,pH 调至7.0,121 ℃灭菌20 min,冷却至50 ℃时加入氨苄青霉素20 mg∕L、新生霉素5 mg∕L、放线菌酮25 mg∕L。

取1.2.3 节中的摇培提取液100 μL,于半选择性KB 培养基上均匀涂板,超净台内吹干,置于28 ℃恒温培养箱中倒置培养48 h 后观察结果。 各处理设置3 个重复。 平板上菌落的计数标准为(个∕皿) -:菌落数为0;+:0 ＜菌落数≤10; ++:10 ＜菌落数≤100; +++:100 ＜菌落数≤500; ++++:500 ＜菌落数;+++++:菌落长满整个平板连成片[ 19]。

总菌落DNA 提取及PCR 检测:无菌水冲洗半选择性KB 培养基表面上的所有细菌菌落,离心浓缩,并提取基因组DNA[ 18],以此为模板,进行PCR 验证。 反应体系及扩增程序同1.2.3 节。

1.2.5 杀菌剂处理对种子发芽的影响

取1.2.3 节杀菌剂处理后的种子各100 粒,无菌水浸泡12 h 后置于培养皿中,无菌水棉球保湿,35 ℃恒温培养箱中催芽24 h,统计发芽率和根长。

1.2.6 杀菌剂处理对苗期发病的影响

育苗基质采用灭菌的泥炭和蛭石,以体积比3∶1的比例混合,装入50 孔的育苗穴盘中,用无菌水浇透。 取1.2.3 节杀菌剂处理后的种子,每个处理播1 盘,各处理重复3 次。 培养条件为:8 h 光照,28 ℃;16 h 黑暗,20 ℃;湿度50%—70%。 出苗10 d 后,统计发病率。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌剂对甜瓜细菌性果斑病菌的抑菌效果

如图1 和表2 所示,16 种杀菌剂中仅有5 种能形成不同直径的抑菌环。 杀菌剂1 号各稀释倍数均具有明显的抑菌环,其中以100 倍液的抑菌环直径最大,抑菌效果最佳,抑菌率可达78.62%;200 倍液和300 倍液的抑菌率分别为68.72%和67.41%。 0.3%四霉素的3 个稀释倍数也具有不同直径的抑菌环,其中以250 倍液的抑菌环直径较大,抑菌效果相对较好,抑菌率为60.94%,与500 倍液和750 倍液之间存在显著差异。 萎锈·福美双原液和100 倍液也有抑菌效果,且原液和100 倍液的抑菌环大小存在显著差异。 2%春雷霉素和4%咯菌·噻霉铜仅原液具有抑菌效果。 综合考虑药剂的抑菌效果及实际使用成本,后续试验分别选用杀菌剂1 号200 倍液、萎锈·福美双100 倍液和0.3%四霉素250 倍液进行。

图1 不同杀菌剂对甜瓜细菌性果斑病菌的抑菌环比较Fig.1 Comparison of antibacterial rings of different bactericides against bacterial fruit blotch pathogens in melon

表2 不同杀菌剂对甜瓜细菌性果斑病菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial effects of different bactericides on bacterial fruit blotch pathogens in melon

2.2 不同杀菌剂的杀菌效果

2.2.1 PCR 检测

依据抑菌环结果,用杀菌剂1 号200 倍液、萎锈·福美双100 倍液和0.3%四霉素250 倍液对带菌种子分别进行30 min、60 min 和90 min 的杀菌处理,并以处理后的种子摇培液为模板进行PCR 检测。 如图2 所示,所有处理均能检测到特异性目的条带(279 bp)。

图2 不同杀菌剂处理带菌种子的PCR 检测Fig.2 PCR detection of seed treated with different bactericides

2.2.2 活菌分离和病原菌检测

为进一步检验杀菌剂处理后是否还有存活的细菌性果斑病菌,进行了活菌分离验证。 结果表明:杀菌剂1 号200 倍液分别处理带菌种子30 min、60 min 和90 min 后,半选择性KB 培养基上均无菌落长出,病原菌被有效杀灭。 带菌种子经萎锈·福美双100 倍液处理30 min、60 min 和90 min 后,平板上均长满菌落,与对照相当;经0.3%四霉素250 倍液处理不同时间后,48 h 内长出的菌落数量与对照相比均明显减少(表3)。 对半选择性KB 平板上长出的总菌落进行DNA提取及病原菌PCR 检测,如图3 所示,均能检测到细菌性果斑病菌的特异性目的条带(279 bp),表明带菌种子经0.3%四霉素250 倍液和萎锈·福美双100 倍液处理后仍有部分病原菌存活。

图3 半选择性KB 培养基上总菌落的PCR 检测Fig.3 PCR detection of bacterial colonies on semi-selective KB medium

表3 不同杀菌剂处理后的种子悬浮液在半选择性KB 培养基上的涂板结果Table 3 Culture results of seed suspensions treated with different fungicides on semi-selective KB medium

综上可知,带菌种子经杀菌剂1 号200 倍液处理后未能分离出病原活菌,杀菌效果最佳;其次是0.3%四霉素250 倍液,处理后虽仍能检测到病原活菌,但菌落总数比对照明显减少;而萎锈·福美双100倍液处理后既能检测到病原活菌,且菌落总数与对照无明显差异。 故选取前2 种杀菌剂进行后续种子发芽及苗期发病试验。

2.3 杀菌剂处理对种子发芽的影响

依据病原菌存活检测的结果,选取经杀菌剂1 号200 倍液和0.3%四霉素250 倍液处理后的种子进行发芽试验,结果表明:所有处理及对照的发芽率均在90%以上。 与对照(95.9%)相比,除杀菌剂1 号200 倍液处理30 min 后发芽率(93.9%)略有降低外,其他处理均高于对照。 带菌种子经杀菌剂1 号200 倍液分别处理30 min 和60 min 后,平均根长与对照相比无显著差异;但处理90 min 后,平均根长显著低于对照。 带菌种子经过0.3%四霉素250 倍液分别处理30 min、60 min 和90 min 后,平均根长与对照相比均有显著提高(表4)。

表4 不同杀菌剂处理对种子发芽的影响Table 4 Effects of different bactericides on seed germination

2.4 杀菌剂处理对苗期发病的影响

出苗10 d 后,幼苗开始出现病症。 如表5 所示,带菌甜瓜种子经0.3%四霉素250 倍液和杀菌剂1 号200 倍液处理后,苗期的发病率与对照相比均有显著降低,但该2 种杀菌剂不同处理时间的苗期发病率无显著差异。

表5 不同杀菌剂处理对幼苗发病率的影响Table 5 Effects of different bactericides on incidence rate of seedlings

3 结论与讨论

甜瓜细菌性果斑病的传播主要依赖于种子带菌传播,播种后在设施内的高温、高湿环境下,病害可迅速蔓延[ 20]。 因此,种子杀菌处理是防治甜瓜细菌性果斑病的有效手段。

本研究通过抑菌环试验,对16 种杀菌剂进行了筛选,发现其中5 种杀菌剂对细菌性果斑病菌有不同程度的抑菌效果。 结合实际使用成本,选用抑菌效果较好的3 种杀菌剂(杀菌剂1 号200 倍液、萎锈·福美双100 倍液和0.3%四霉素250 倍液)对带菌种子进行处理。 经PCR 检测,处理后的种子均能检测到特异性目的条带;进一步活菌分离试验发现,杀菌剂1 号200 倍液处理带菌种子后,在半选择性培养基上无菌落长出,0.3%四霉素250 倍液处理检测到的菌落总数与对照相比明显减少,而萎锈·福美双100 倍液的处理与对照无明显差异。 杀菌剂1 号的有效成分为异噻唑啉酮和二硫氰甲烷[ 19],在杀菌过程中可使病原菌的蛋白质变性,消灭细胞的活性,也可使病原菌的遗传基因发生变异或干扰细胞内部酶的活性使其难以繁殖生长,从而起到抑制作用[ 21];0.3%四霉素属于抗生素类杀菌剂,主要对病原菌的细胞壁、细胞膜、蛋白质合成系统及能量代谢系统等起作用,还可作用于植物,激发抗性防御反应[ 22]。 另外,带菌种子经杀菌剂处理后虽然PCR 检测结果仍然为阳性,但病菌可能已被杀死,PCR 检测到的可能是部分死菌的残留DNA,这与李菊芬等研究结果一致[ 9]。 因此,PCR 检测具有一定的局限性,应进一步结合活菌分离试验,这样的检测结果才更可靠。

种子发芽试验表明,与对照相比,杀菌剂1 号200 倍液和0.3%四霉素250 倍液分别处理30 min、60 min 和90 min 后对种子发芽率无明显影响;但杀菌剂1 号200 倍液处理90 min 后对平均根长有显著抑制作用,其有效成分异噻唑啉酮和二硫氰甲烷均具有一定腐蚀性[ 19],随着处理时间的延长,渗透过种皮,可能对种胚造成一定影响,延缓了根的伸长。 0.3%四霉素250 倍液的主要成分为抗生素,经微生物发酵获得,内含的有机营养成分可能对胚根生长具有一定促进作用。

苗期发病试验显示,经杀菌剂1 号200 倍液和0.3%四霉素250 倍液处理后的带菌种子,其苗期发病率与对照相比均显著降低,且同一杀菌剂不同时间处理的苗期发病率之间无显著差异。 虽然在杀菌剂1号200 倍液处理后的带菌种子中未检测到病原活菌,但在苗期依然有一定的发病率,这可能是由于甜瓜细菌性果斑病菌不仅存活于种子表面,种子内部也有寄藏,且具有高抗逆性和存活时间较长的特点,因而对检测和杀菌造成难度[ 23]。

综上,采用杀菌剂1 号200 倍液或者0.3%四霉素250 倍液处理带菌甜瓜种子60 min,可有效杀灭种子所携带的细菌性果斑病菌,而且对种子发芽和生长无明显不良影响,还可显著降低幼苗的发病率。 种子处理可从源头对病害进行预防和控制,对甜瓜生产实践具有重要的应用价值。