食用菌促生细菌研究进展

于 潇,李冠喜

(曲阜师范大学生命科学学院,曲阜 273165)

食用菌通常指子实体硕大、可供食用的大型真菌,一般通称为蘑菇[ 1]。 目前大约有14 000 种食用菌被成功鉴定,其中10%为大型真菌[ 2]。 约有700 种食用菌可安全食用,且对人体健康有益[ 3]。

食用菌促生细菌(Mushroom growth-promoting bacteria,MGPB)[ 4]是指通过分泌或者分解某种物质对食用菌生长产生促进作用的有益细菌。 最早发现并应用的促生细菌为植物根际促生菌(Plant growthpromoting rhizobacteria,PGPR),是生存于植物根际、根表,对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌[ 5]。 Frey-Klett 等[ 6]研究发现,在许多环境中,细菌和真菌是共存并相互作用的。 细菌在食用菌的不同发育阶段均起着重要的作用。 Kong 等[ 7]利用宏基因组测序技术研究了平菇栽培中玉米芯堆肥微生物群落的动态变化及其代谢功能,发现不同堆肥阶段优势菌门不同。 食用菌促生细菌(MGPB)可以通过分泌生长激素、分解代谢营养菌丝产生的抑制性挥发物、增溶磷酸盐、产铁载体和1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(Acc deaminase)促进食用菌的生长[ 8]。 虽然MGPB 对于食用菌的生产十分有利,但是和PGPR 相比,目前用于食用菌栽培的MGPB 的种类和数量还十分有限[ 4]。 本文就MGPB 对食用菌的促生作用及机理进行综述,同时对其应用前景进行讨论和展望,以期为MGPB 更深入的研究提供理论指导。

1 食用菌促生细菌获得方法

1.1 细菌的分离

目前,促生细菌主要从食用菌子实体内部或食用菌生存环境中分离。 从食用菌子实体内部分离促生细菌需先对子实体表面进行消毒,目前使用的消毒方法较多,如Xiang 等[ 9]利用70%乙醇消毒60 s,然后用1.0%次氯酸钠消毒5 min,70%乙醇消毒30 s,用无菌蒸馏水彻底清洗;Ding 等[ 10]则是先用自来水洗净,再用70%乙醇浸泡1 min,然后用1%次氯酸钠处理10 min,再将子实体用无菌水多次洗涤;还可用0.1%的氯化汞溶液也可代替次氯酸钠溶液进行消毒[ 11]。 之后,取最后一次的洗涤水涂在营养琼脂平板,适宜温度下培养3 d 进行无菌检查,采用研磨法、印迹法或组织分离法分离细菌[ 12]。

从食用菌具体生存环境中分离促生细胞需要制作菌悬液,不同研究选用的制作方法不同。 Xing等[ 13]将1 g 样品悬浮在9 mL 无菌水中,摇瓶培养15 min。 Young 等[ 4]将采集到的土壤与无菌水以1∶1(w∕w)比例浸泡,并在25 ℃下摇瓶培养30 min。 Kumari 等[ 8]则将1 g 土壤混合到2 mL 无菌水中,并适当摇动。 样品和无菌水的比例以及摇瓶培养时间和温度可以根据实际情况进行调整,如杏鲍菇的适宜温度为23—25 ℃[ 14],平菇为15—25 ℃[ 15]。 摇瓶培养后涂板培养,平板培养基可以是溶菌肉汤培养基(Lysogeny broth,LB)、大豆酪蛋白琼脂培养基(Tryptose soya agar,TSA)、R2A 琼脂培养基(R2A agar,R2A)[ 16]或营养琼脂(Nutrient agar,NA)[ 4]等。 之后选取形态不同的单菌落进行纯化并保存。

1.2 促生细菌作用的测定

可通过平板试验,检测分离出的细菌是否为促生细菌。 王琳等[ 17]将平板分为十字对称的4 个区域,真菌菌丝块置于十字中心,取一定浓度的菌液点涂在十字四条线的中点位置,观察菌丝在点菌位置与平板上无细菌区域的生长差异。 Lim 等[ 18]将刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)菌丝块放在PDA 平板中央后,用菌液在菌丝块两侧划两条平行直线,以观察细菌与真菌共生情况。 Kim 等[ 19]和Rainey[ 20]将培养一定天数的菌液加入到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中,均匀涂布,并将真菌菌丝块置于培养基中央进行共培养,观察菌丝是覆盖细菌菌落还是避开菌落生长。 Suarez 等[ 16]研究发现,共同培养7 d 内,卢平小单胞菌(Micromonospora lupini)对糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)无促生作用,但21 d 后,糙皮侧耳菌丝继续径向生长,说明细菌和真菌之间是需要一定时间来适应的,且通常是通过双方代谢产物以互利互惠而不是消耗彼此菌体。 Vos 等[ 21]研究发现,双孢蘑菇(Agaricus bisporus)可以通过降解纤维素为堆肥中的细菌提供单糖,而细菌可以为双孢蘑菇提供维生素等物质。 Rangel-Castro 等[ 22]发现,与鸡油菌共生的假单胞菌属细菌是受益于真菌产生的糖和氨基酸等营养物质,而不是通过水解真菌细胞壁来获得营养。 另外,荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescent)可以为双孢蘑菇提供生长激素促进其生长[ 9]。

判断1 株细菌是否是MGPB,还可通过细菌-菌丝液体共培养的方式进行,主要通过比较菌丝重量变化来判断细菌的促生效果[ 23]。 值得注意的是,细菌对食用菌的促生作用不一定表现在促进菌丝的生长上。 Young 等[ 4]研究发现,在平皿共培养中对巴氏蘑菇(Agaricus blazei)菌丝生长无积极作用的细菌,对其出菇反而有促进作用。 而Min 等[ 19]也发现有一种假单胞菌的上清液除了能让刺芹侧耳菌丝生长速率提高1.6 倍外,还能诱导原基形成。

通过对食用菌促生细菌16S rDNA 进行测序,并结合细菌形态学等指标来确定细菌的属或种。 部分已经验证的MGPB 及其所作用的食用菌种类见表1。

表1 部分MGPB 及其所作用的食用菌Table1 Part of MGPB and relevant mushroom

2 食用菌促生细菌的作用机制

2.1 细菌顶空化合物

细菌产生并释放的挥发性次生代谢物称为细菌顶空化合物[ 16]或细菌挥发性化合物[ 30](BVC)。 BVC多种多样,如脂肪酸衍生物(碳氢化合物、酮、醇)、酸、含硫、含氮化合物和萜烯等有机物,及一氧化氮、硫化氢、氨、氰化氢等无机物。 Suarez 等[ 16]首次采用双平板共培养法分析了BVC 对糙皮侧耳菌丝生长的影响,该方法是利用二分格平皿将细菌与真菌分隔开,一格培养细菌(用细菌培养基),一格放入糙皮侧耳菌丝块(用真菌培养基)。 糙皮侧耳菌丝和细菌二者之间不接触,细菌产生的BVC 可以通过平皿上方的间隙挥发到糙皮侧耳菌丝处并对其产生影响。

顶空固相微萃取-气质联用技术[ 31](HS-SPME-GC-MS)可以对BVC 各成分进行测定与分析。 杨柳等[ 32]利用该技术,对鹰嘴豆纳豆发酵过程中挥发性成分进行了检测。 Gong 等[ 33]发现黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)产生的挥发物能够通过抑制植物病原真菌的生长来促进玉米的生长,利用顶空固相微萃取-气质联用技术分析其挥发物成分,发现其中起作用的是二甲基二硫醚(C2H6S2)。

2.2 可溶性化合物

为验证细菌产生的可溶性化合物对食用菌生长的影响,Suarez 等[ 16]将菌丝块放在PDA 平板中央,用菌液在菌丝块两侧划两条平行的直线,培养7 d 后,发现部分细菌对菌丝生长起正面影响。 Chen 等[ 27]用不同体积的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)发酵液加入到刺芹侧耳菌丝培养的平皿中,发现不同体积上清均能促进其菌丝生长。 Lim 等[ 18]发现不同浓度细菌发酵液对刺芹侧耳菌丝生长有促进作用。 Kim 等[ 19]发现,在菌丝满瓶前加入1 株假单胞菌属(Pseudomonassp.)细菌的上清液可以缩短原基的形成时间。

2.3 酶类物质

细菌对食用菌的促生作用离不开酶的作用,正是因为特定酶的活动,MGPB 才表现出解纤维素(为食用菌生长提供碳源)、分解乙烯(减轻其对菌丝生长的抑制)、合成生长激素(促进食用菌生长)亦或者是消耗1-辛烯-3-醇等(解除其对食用菌原基形成的抑制)特征。

2.4 细菌菌体

研究发现,一些细菌紧密附着在菌丝上以刺激菌丝的生长发育。 Rainey[ 20]发现恶臭假单胞菌可通过与双孢蘑菇菌丝接触的方式来减少其分枝频率以提高径向增长速率。 Chen 等[ 34]也发现恶臭假单胞菌是附着在双孢蘑菇菌丝上的。 Kumari 等[ 8]通过电镜观察发现被1 株谷氨酸杆菌(Glutamicibacter arilaitensis)附着的佛州侧耳(Pleurotus florida)菌丝更厚、更健康。 此外,细菌菌体还可通过分泌生长素和降解有害物质等方式促进食用菌的生长发育。

3 促生长细菌的关键特征

3.1 解纤维素

食用菌生产用基质根据其成分可分为三类[ 35]。 第一类是原木;第二类是在培养料中添加木屑,制成人造原木;第三类则是除添加木屑外,还添加秸秆[ 36](包括玉米秆、麦秆、稻草等)、麸皮[ 37]、玉米芯[ 38]、棉籽壳[ 37]等富含纤维素的成分。 Michael 等[ 35]认为香菇等木腐菌菌丝生长速度取决于其本身对木质纤维素的降解能力。 高纤维素酶含量是双孢蘑菇整个生殖阶段的特征[ 39]。 而纤维素降解菌可以提高秸秆降解效果并缩短降解时间[ 40]。 Xiang 等[ 9]发现了1 株产纤维素酶能力较强的解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus),推测其可能通过降解纤维素为双孢蘑菇提供碳源。 Kasana 等[ 41]提供了一种快速筛选产纤维素酶细菌的方法,即以纤维素为唯一碳源的培养基培养细菌后,加入革兰氏碘(Gram’s iodine)溶液代替刚果红或者十六烷基三甲基溴化铵。 这种方法操作简单,且安全性和效率更高。

3.2 分解乙烯

在食用菌的栽培过程中会产生乙烯,而乙烯对食用菌子实体的发育有抑制作用。 1975 年,Turner等[ 39]用气相色谱-质谱联用仪分析发现,乙烯是由菌丝体-堆肥复合体产生的,而不是由子实体本身产生的[ 39]。 Wood 等[ 42]和Ohga[ 43]也分别在双孢蘑菇和香菇的研究中发现,乙烯是在菌丝生长和子实体发育阶段从基质中产生的。 Turner 等[ 39]研究认为,在整个食用菌的生长发育过程中,从菌丝的生长到子实体的成熟,乙烯不断增多。 周巍巍等[ 44]发现双孢蘑菇可以在生长发育过程中产生乙烯,且其乙烯合成途径可能与高等植物相同。 Chen 等[ 34]研究也证明双孢蘑菇有与高等植物相似的乙烯合成途径。 董晓雅等[ 29]研究发现,荧光假单胞菌悬液、乙烯受体抑制剂AgNO3、乙烯合成抑制剂CoCl2可显著提高食用菌菌丝的生长速度。 Chen 等[ 34]发现了1 株产ACC 脱氨酶的恶臭假单胞菌,它可以分解ACC 以降低乙烯的浓度,从而促进双孢蘑菇菌丝的生长,诱导原基的形成。

3.3 其他特征

生长激素(IAA)促进食用菌的生长,许多细菌能通过编码tnaA生成的色氨酸酶将色氨酸转化成吲哚[ 30,45]。 有些促生细菌可以通过解磷作用促进食用菌生长[ 46]。 还有些细菌通过消耗1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)来促进食用菌生长。 而有些细菌能够利用并代谢影响食用菌子实体发育的物质[ 47]。Zarenejad 等[ 48]发现从覆土中分离的细菌中有97%的菌株能够在高浓度的1-辛烯-3-醇挥发性化合物存在下生长,接种具有这一特性的菌种可使双孢蘑菇的产量提高14%,这在工业化生产中具有重要意义。

MGPB 也可以通过产生铁载体[ 48]、固氮[ 49]或者是抑制霉菌的生长[ 50]来促进食用菌的发育和生长。以上提到的促生特征中有很多也是PGPR 的特征[ 51],其可以为MGPB 的开发提供思路和切入点。

4 总结和展望

虽然食用菌工厂化发展迅猛,但暴露的问题越来越多,如病虫害日趋加重、农残超标、产业效益下滑等。 蘑菇生长促进剂(Mushroom growth promoting,MGP)有两种形式,即活体制剂和代谢产物制剂[ 5],可用于提高作物产量[ 52]。 活菌制剂因含有活菌体,利于改良作物生活环境及其本身的微生态环境,具有良好的生态学意义。 目前,以生物制剂代替化学制剂促进食用菌生长是食用菌种植业面临的一个新的、迫切需要解决的问题[ 8]。

MGPB 具备产纤维素酶、溶解磷酸盐、产IAA 及ACC 脱氨酶等特征。 MGPB 还可以消耗双孢蘑菇菌丝产生的但抑制子实体发育的1-辛烯-3-醇。 不同MGPB 具有不同的促生特征,未来或许可以将已有的MGPB 菌株改造为无毒无害的高效工程菌株或寻找到促生效果更优秀的菌株,用于制备更优质的生物制剂,以改善食用菌品质,促进食用菌行业健康发展。