基于一测多评法含量测定及薄层鉴别的经典名方竹茹汤颗粒剂的质量评价研究

何天雨，梅 茜，王晓丽，毛 靖，谢 辉，郭 勇，侯金才，陆兔林，毛春芹*

基于一测多评法含量测定及薄层鉴别的经典名方竹茹汤颗粒剂的质量评价研究

何天雨1，梅 茜1，王晓丽1，毛 靖1，谢 辉1，郭 勇2，侯金才2，陆兔林，毛春芹1*

1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023 2. 神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430

建立经典名方竹茹汤颗粒（Zhuru Decoction Granules，ZDG）特征图谱及一测多评（quantitative analysis multi-components by single marker，QAMS）法测定其主要成分，优化薄层色谱条件，建立同时鉴别葛根素和甘草苷的方法。优化并确定HPLC最佳色谱条件并建立特征图谱，以葛根素作为参照物，建立葛根素、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸的QAMS法，建立主要药效成分葛根素及甘草苷同时鉴别的薄层条件。得到15批样品特征图谱与其对照图谱的相似度均大于0.95；15批制剂运用QAMS法和外标法得到的各成分含量无显著性差异，7种成分相对误差均低于5%；通过稳定性考察证明薄层检测条件稳定可行。该方法科学可行，稳定可控，有助于经典名方ZDG质量控制方法的完善和提高，为经典名方的质量控制评价提供参考。

经典名方；竹茹汤；特征图谱；一测多评法；薄层鉴别；葛根素；甘草苷；3′-羟基葛根素；3′-甲氧基葛根素；葛根素芹菜糖苷；大豆苷；甘草酸

近年来，经典名方成为中医药领域的研究热点之一，国家药监局制定了《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》[1]传承发展中医药事业。竹茹汤出自宋代许叔微《普济本事方》，位列《古代经典名方目录（第一批）》第35首，该方重用葛根升阳祛风、升清降浊、生津清热，半夏（姜汁浆水制）、竹茹、生姜用以安胃止呕，同时发挥甘草（水炙）、大枣利脾健气、调和诸药的功效，六药合用，共奏益胃清热，临床主要用于治疗胃热呕吐，症见手足心俱热[2-5]。

中成药复方制剂由多味中药材组方而成，多成分协同作用，作用效果多靶点，目前多指标成分评价模式已被逐步应用于相关质量控制中[6-9]，但采用外标法进行多指标含量测定时，往往需要较多成分作为对照品，而对照品存在分离纯度难度大，不易获得，价格相对昂贵等问题限制了外标法在复方制剂多指标质量控制和评价中的应用。一测多评法（quantitative analysis multi-components by single marker，QAMS）利用中药有效成分内在函数关系和比例关系，以样品中对照品廉价易得的常见成分为内参物，计算出其他待测成分间的相对校正因子，实现多个待测成分的同步测定，具有操作成本低、简单、快捷的优点，适用于药效成分复杂多样的中药及中药制剂，符合中药多成分、多功效的作用特点[10-13]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；Waters e2695型高效液相色谱仪，美国Waters公司；色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Merck Purospher Star LP RP-18End Capped柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；FA1104N型电子天平，上海菁海仪器有限公司；KQ-500B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q型纯水机。

1.2 试药

对照品葛根素（批号110752-201615，质量分数95.4%）、6-姜辣素（批号111833-201303质量分数≥98%）购自中国食品药品检定研究院；对照品3′-羟基葛根素（批号180102，质量分数≥98%）、3′-甲氧基葛根素（批号171204，质量分数≥98%）、葛根素芹菜糖苷（批号171216，质量分数≥98%）均购自南京森贝伽生物科技有限公司；对照品大豆苷（批号20111016，质量分数≥98%）、大豆苷元（批号YY20101110，质量分数≥98%）、甘草苷（批号201027BA14，质量分数≥98%）、甘草酸单铵盐（批号20120911，质量分数≥98%）均购自上海源叶生物技术有限公司。甲醇，分析纯，山东禹王实业有限公司化工分公司；乙腈，色谱纯，默克股份两合公司；甲酸，色谱纯，美国恩科公司；水为娃哈哈纯净水。其他试剂均为分析纯。薄层板分别购于青岛海洋化工有限公司、青岛康业鑫有限公司、上海阿拉丁生化科技股份有限公司芯硅谷厂家。

竹茹汤由葛根、甘草、半夏、竹茹、生姜和大枣6味药组成，均购自道地产区或主产区，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，其中葛根来自陕西，为豆科葛属植物野葛(Willd.) Ohwi的干燥根；半夏来自江苏泰州，为天南星科半夏属植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥块茎；甘草来自甘肃榆中，为豆科甘草属植物甘草Fisch.的干燥根和根茎；竹茹来自广东广宁，禾本科刚竹属植物淡竹(Lodd.) Munro var.(Mitf.) Stapf ex Rendle的茎秆的干燥中间层；生姜来自四川沐川，为姜科姜属植物姜Rosc.的新鲜根茎；大枣来自山西闻喜，为鼠李科枣属植物枣Mill.的干燥成熟果实，甘草、半夏按课题组前期研究制定的《水炙甘草工艺及质量标准》（草案）、《姜汁浆水制半夏工艺及质量标准》（草案）炮制成符合要求的饮片。药材及对应饮片来源与批号见表1。竹茹汤颗粒（Zhuru Decoction Granules，ZDG），每袋质量6 g，批号2022071301、2022071302、2022071303、2022071304、2022071305、2022071306、2022071307、2022071308、2022071309、202207131、2022120101、2022120102、2022120103、2022120104、2022120105，分别编号S1～S15，由神威药业集团有限公司提供。

表1 药材及对应饮片来源

Table 1 Source of medicinal materials and corresponding decoction pieces

药材产地饮片炮制标准 葛根陕西商洛《中国药典》2020年版一部“葛根” 甘草甘肃榆中《水炙甘草炮制及质量标准研究》（草案） 半夏江苏泰州《姜汁浆水制半夏工艺及质量标准研究》（草案） 竹茹广东广宁《中国药典》2020年版一部“竹茹” 生姜四川沐川《中国药典》2020年版一部“生姜” 大枣山西闻喜《中国药典》2020年版一部“大枣”

2 方法与结果

2.1 ZDG的制备

分别称取1份处方量竹茹汤（葛根13.77 g、甘草3.44 g、半夏3.44 g、竹茹3 g、生姜3 g、大枣3 g），加水600 mL，浸泡60 min，以红外炉最大功率2200 W加热至沸腾，调整火力至900 W，煎煮至半，趁热采用80目筛滤过，放冷，定容至300 mL，即得竹茹汤基准样品。

2.2 色谱条件

色谱柱为Kromasil 100-5C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～4 min，0.5%～9.0%乙腈；4～15 min，9.0%～12.0%乙腈；15～20 min，12.0%乙腈；20～35 min，12.0%～16.0%乙腈；35～38 min，16.0%～23.0%乙腈；38～48 min，23.0%～30.0%乙腈；48～63 min，30.0%～75.0%乙腈；63～64 min，75.0～0.5%乙腈；体积流量为1 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL，检测波长为280 nm。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液 精密称取3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸对照品适量，用甲醇稀释，即得含3′-羟基葛根素244 μg/mL、葛根素1350 μg/mL、3′-甲氧基葛根素425 μg/mL、葛根素芹菜糖苷385 μg/mL、大豆苷750 μg/mL、甘草苷114 μg/mL、甘草酸176 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液 取装量差异项下的ZDG，混匀，取适量，研细，取约0.50 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声10 min（功率250 W、频率40 kHz），放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 阴性样品溶液 按照处方比例［葛根13.8 g、甘草（水炙）3.4 g、半夏（姜汁浆水制）3.4 g、生姜3.0 g、竹茹3.0 g、大枣3.0 g］，按照前期课题组确定的颗粒剂制备方法分别制备缺葛根、缺甘草、缺生姜的阴性样品，按照“2.3.2”项下方法制备，即得各阴性样品溶液。

2.3.4 薄层对照品溶液 另取葛根素对照品，加甲醇制成含葛根素1 mg/mL的对照品溶液；另取甘草苷对照品，加甲醇制成含甘草苷1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.3.5 薄层供试品溶液 取ZDG 2 g，加甲醇30 mL，超声处理（功率250 W、频率50 kHz）30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。

吸取竹茹汤基准样品5 mL，同法将其制备成竹茹汤基准样品对照溶液。

2.3.6 薄层阴性样品溶液 取葛根阴性颗粒2 g，同法将其制备成葛根阴性对照溶液；取甘草阴性颗粒2 g，同法将其制备成甘草阴性对照溶液。

2.4 特征图谱建立

2.4.1 精密度试验 取同一批ZDG样品（批号2022071301）按照“2.3.2”项下方法制备成为供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以5号峰（葛根素）为参照峰，计算所有共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果特征图谱相似度＞0.98，特征峰的相对保留时间RSD均小于0.13%，相对峰面积RSD均小于0.82%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批ZDG样品（批号2022071301），按照“2.3.2”项下方法操作条件平行制备6份供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件连续进样，记录色谱图，以5号峰（葛根素）为参照峰，计算所有共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果特征图谱相似度＞0.96，特征峰的相对保留时间RSD均小于0.13%，相对峰面积RSD均小于3.88%，表明该方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一批ZDG样品（批号2022071301），按照“2.3.2”项下方法操作制备成为供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h在“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以5号峰（葛根素）为参照峰，计算所有共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果特征图谱相似度＞0.96，特征峰的相对保留时间RSD均小于0.05%，相对峰面积RSD均小于0.64%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 特征图谱的建立及分析 将样品所得色谱数据利用Chromeleon73软件导出特征图谱CDF格式，并导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评个系统》（2012，130723版）软件进行分析。

选择分离度较好、纯度较高且成分已知的5号峰（葛根素）作为ZDG特征图谱的参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。采用中位数法生成对照特征图谱，设定S1为参照图谱，时间窗宽度为0.1 mm，自动匹配后多点校正，进行全谱峰匹配，得到15批ZDG样品（S1～S15）的对照特征图谱（图1）。

4-3′-羟基葛根素 5-葛根素 7-3′-甲氧基葛根素 8-葛根素芹菜糖苷 9-大豆苷 12-甘草苷 14-甘草酸

全方共确定15个共有峰，经对照品、ZDG样品、阴性样品的相关图谱（图2）色谱峰比对，确定其中峰4为3′-羟基葛根素、峰5为葛根素、峰7为3′-甲氧基葛根素、峰8为葛根素芹菜糖苷、峰9为大豆苷、峰12为甘草苷、峰14为甘草酸。

1-3′-羟基葛根素 2-葛根素 3-3′-甲氧基葛根素 4-葛根素芹菜糖苷 5-大豆苷 6-甘草苷 7-甘草酸

计算15批ZDG样品（S1～S15）与其对照特征图谱的相似度分别为0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、0.999、0.999、0.998、0.999，均大于0.95，表明ZDG及制备工艺稳定，不同批次间的差异较小。

2.5 指标成分含量测定方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取“2.3.1”项下的混合对照品溶液（3′-羟基葛根素244 μg/mL、葛根素1350 μg/mL、3′-甲氧基葛根素425 μg/mL、葛根素芹菜糖苷385 μg/mL、大豆苷750 μg/mL、甘草苷114 μg/mL、甘草酸176 μg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、2.0 mL至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度线，制成系列混合对照品溶液II～VI。

将不同质量浓度的混合对照品溶液I～VI，按照“2.2”项下色谱条件进样测定，以对照品质量浓度作为横坐标（），峰面积积分值作为纵坐标（），绘制标准曲线，进行线性回归得回归方程：3′-羟基葛根素＝17 787＋299 860，＝0.999 8，线性范围24.4～244.0 μg/mL；葛根素＝9 431.4＋93 790，＝0.999 4，线性范围135.0～1 350.0 μg/mL；3′-甲氧基葛根素＝9 680.3－82 200，＝0.999 9，线性范围42.5～425.0 μg/mL；葛根素芹菜糖苷＝10 184－59 226，＝0.999 9，线性范围38.5～385.0 μg/mL；大豆苷＝10 472－193 440，＝0.999 9，线性范围75.0～750.0 μg/mL；甘草苷＝6 857.0－9 627.4，＝0.999 6，线性范围11.4～114.0 μg/mL；甘草酸＝2 737.0－11 248，＝0.999 9，线性范围17.6～176.0 μg/mL；结果表明，各成分在各自质量浓度范围内线性关系良好。

2.5.2 专属性考察 精密吸取“2.3.3”项下阴性样品溶液、“2.3.1”项下对照品溶液及“2.3.2”项下ZDG供试品溶液各5 μL，按确定的色谱条件进行测定，结果见图2，结果显示，在此条件下，ZDG中葛根、甘草和生姜的色谱峰分离较好，互不干扰，说明方中各药味色谱峰的专属性良好。

2.5.3 精密度试验 精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次进行测定，测得3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD分别为0.62%、0.59%、0.61%、0.64%、0.45%、0.80%、1.13%，说明仪器的精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号2022071301），室温下于制备后0、2、4、8、12、24 h在“2.2”项下色谱条件进样测定，得3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD分别为2.25%、1.06%、1.21%、1.41%、1.12%、1.21%、0.97%，结果表明供试品溶液在制备后24 h内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 取同一批样品（批号2022071301），按照“2.3.2”项下条件平行制备6份供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件进行测定，测得3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸质量分数的RSD分别为1.83%、0.85%、0.93%、0.76%、0.48%、0.83%、0.30%，说明该方法的重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验 取6份装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，分别取约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，取与供试品等量的对照品，加50%甲醇至10 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W、频率40 kHz）10 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，计算各成分的加样回收率及其RSD。结果3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸的平均加样回收率分别为102.01%、97.36%、102.12%、99.57%、97.18%、96.96%、101.57%，RSD分别为0.40%、1.75%、0.82%、1.47%、1.63%、1.72%、0.87%，表明该方法的准确度良好。

2.6 QAMS建立

2.6.1 相对校正因子（s/i）的测定 按照“2.2”项下色谱条件，将“2.3.1”项下的混合对照品溶液分别进样2、5、8、10、15、22 μL，记录各成分峰面积，以葛根素为内参物，采用多点校正法，按照公式s/is/fsC/ACs计算，其中s为葛根素对照品的峰面积，s为葛根素对照品的质量浓度，A为待测成分峰面积，C为待测成分的质量浓度。

分别计算3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸的s/i，结果5个待测成分与内参物s/i的RSD值均小于3%，结果见表2。

2.6.2 不同仪器和不同色谱柱考察 考察了Waters e2695和Agilent 1260 2种高效液相色谱仪及Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Merck Purospher Star LP RP-18End Capped柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）2种色谱柱对s/i的影响，并计算RSD，结果均小于2%，表明不同仪器和色谱柱适用性良好。结果见表3。

表2 各成分fs/i

Table 2 fs/i values of each component

进样体积/μLf葛根素/3′-羟基葛根素f葛根素/3′-甲氧基葛根素f葛根素/葛根素芹菜糖苷f葛根素/大豆苷f葛根素/甘草苷f葛根素/甘草酸 20.552 20.512 70.545 00.548 70.361 50.145 6 50.553 10.514 50.545 80.555 40.364 30.145 0 80.554 70.516 60.547 30.553 80.369 90.145 1 100.555 00.517 80.548 70.555 40.373 60.145 3 150.547 00.524 20.555 40.563 10.379 10.147 4 220.531 50.542 40.570 70.586 90.382 30.153 5 平均值0.548 90.521 40.552 20.560 50.371 80.147 0 RSD/%1.642.111.772.452.192.25

表3 仪器及色谱柱对fs/i的影响

Table 3 Effect of instrument and chromatographic column on fs/i

仪器色谱柱f葛根素/3′-羟基葛根素f葛根素/3′-甲氧基葛根素f葛根素/葛根素芹菜糖苷f葛根素/大豆苷f葛根素/甘草苷f葛根素/甘草酸 WatersKromasil0.563 40.528 90.559 90.566 40.382 40.148 5 Merck0.556 10.524 20.555 40.563 10.379 10.147 4 Agilent 1260Kromasil0.566 20.520 10.551 20.570 10.380 30.146 9 Merck0.551 20.527 90.539 80.569 30.371 20.142 3 平均值 0.559 20.525 30.551 60.567 20.378 30.146 3 RSD/% 1.220.761.560.561.301.87

2.6.3 不同柱温对s/i的影响 采用Waters e2695色谱仪和Kromasil C18色谱柱考察了柱温23、25、27℃对s/i的影响，并计算其RSD，结果均小于3%，表明不同柱温对各成分无显著影响。结果见表4。

2.6.4 不同体积流量对s/i的影响 采用Waters e2695色谱仪和Kromasil C18色谱柱考察了体积流量为0.8、1.0、1.2 mL/min时对s/i的影响，并计算其RSD，结果均小于3%，表明不同体积流量的变化对各成分的s/i无明显影响。结果见表5。

2.7 待测组分色谱峰定位

取混合对照品溶液，选取2只不同品牌色谱柱，按照“2.2”项下色谱条件测定，以葛根素为内参物，计算其他6种成分相对保留时间（s/i），对待测组分进行定位，并计算RSD，结果各待测成分相对保留值得RSD均小于3%，表明采用相对保留值法对待测成分定位合理。结果见表6。

2.8 QAMS与外标法结果对比

取15批样品，按照“2.3.3”项下条件制备供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，采用QAMS法建立内参物葛根素与3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸的s/i，对15批ZDG样品中各成分进行含量测定，同时采用外标法对其进行含量测定，并以相对误差来表示2种方法测得结果的差异，相对误差＝(QAMS－外标法)/外标法（QAMS为QAMS测得的含量，外标法为外标法测得的含量）。结果见表7。结果发现，外标法与QAMS法计算所得到的组分含量基本一致，外标法实测含量值与QAMS法所测成分含量值无显著性差异。QAMS法简化了分析过程，降低分析成本，但在实际应用中可能还存在着局限性[14-16]，为了使QAMS法在同时测定中药多成分中得到广泛应用，还需对QAMS法相关技术进行深入研究。

表4 柱温对fs/i的影响

Table 4 Effect of column temperature on fs/i

柱温/℃f葛根素/3′-羟基葛根素f葛根素/3′-甲氧基葛根素f葛根素/葛根素芹菜糖苷f葛根素/大豆苷f葛根素/甘草苷f葛根素/甘草酸 230.561 30.531 10.562 80.570 00.384 70.149 4 250.556 10.524 20.555 40.563 10.379 10.147 4 270.578 10.538 10.551 60.570 90.388 20.148 5 平均值0.565 20.531 10.556 60.568 00.384 00.148 4 RSD/%2.041.301.020.751.190.66

表5 体积流量对fs/i的影响

Table 5 Effect of volume flow on fs/i

体积流量/(mg∙mL−1)f葛根素/3′-羟基葛根素f葛根素/3′-甲氧基葛根素f葛根素/葛根素芹菜糖苷f葛根素/大豆苷f葛根素/甘草苷f葛根素/甘草酸 0.80.569 80.513 10.540 40.573 80.382 70.150 4 1.00.556 10.524 20.555 40.563 10.379 10.147 4 1.20.571 40.528 50.558 80.564 60.374 40.154 1 平均值0.565 80.521 90.551 50.567 20.378 70.150 6 RSD/%1.481.521.781.021.092.22

表6 各成分相对保留时间

Table 6 Relative retention time of each component

仪器色谱柱t葛根素/3′-羟基葛根素t葛根素/3′-甲氧基葛根素t葛根素/葛根素芹菜糖苷t葛根素/大豆苷t葛根素/甘草苷t葛根素/甘草酸 WatersKromasil0.404 90.530 30.662 60.652 81.141 81.459 3 Merck0.404 70.530 40.662 90.653 21.153 31.533 0 Agilent 1260Kromasil0.404 90.530 20.664 00.652 91.147 01.494 6 Merck0.404 80.530 10.662 70.653 01.143 31.472 5 平均值 0.404 80.530 30.663 10.653 01.146 41.489 8 RSD/% 0.020.020.100.030.452.16

表7 QAMS法与外标法测得15批ZDG中7种成分的质量分数

Table 7 Mass concentrations of seven components in 15 batches of ZDG measured by QAMS and external standard methods

批号3′-羟基葛根素/(mg∙g−1)3′-甲氧基葛根素/(mg∙g−1)葛根素芹菜糖苷/(mg∙g−1)葛根素/(mg∙g−1) 外标法QAMS法相对误差/%外标法QAMS法相对误差/%外标法QAMS法相对误差/% S18.4768.5080.37914.92014.968 0.321 14.56415.3584.83146.002 S28.6538.6900.43214.981 15.027 0.306 14.82415.5994.86646.160 S38.5098.5450.42714.762 14.808 0.311 13.87814.8464.77045.409 S48.4728.5060.40414.492 14.536 0.303 14.87315.0484.80145.552 S58.1048.1280.30314.629 14.676 0.320 14.37815.1744.86344.965 S68.4948.5280.40614.86314.9160.355 14.64015.4344.86745.652 S78.3058.3370.38014.59214.6420.341 14.42315.1654.86244.947 S88.3308.3630.39414.58314.6320.335 14.33815.1194.85744.890 S98.2108.2410.37414.44814.4950.324 14.19414.9994.86044.493 S108.0468.0720.32614.37014.4130.298 14.41014.8794.85644.210 S118.7058.7440.44915.02315.0720.325 14.74715.6004.86446.183 S128.6568.6930.42715.03715.0900.351 14.24715.6664.87146.257 S138.0738.0990.32114.38214.4290.326 14.13415.0044.86644.431 S148.2098.2420.40714.11314.1530.283 14.39914.6864.83443.971 S158.2298.2610.38614.14714.1900.303 14.51214.6694.80144.393 批号大豆苷/(mg∙g−1)甘草苷/(mg∙g−1)甘草酸/(mg∙g−1) 外标法QAMS法相对误差/%外标法QAMS法相对误差/%外标法QAMS法相对误差/% S114.56114.232−2.312 3.5473.6101.7786.4756.5240.755 S214.82214.497−2.242 3.4313.4841.5626.5316.5810.766 S313.88313.525−2.647 3.0093.0320.7786.4006.4490.768 S414.86914.553−2.171 3.4463.5021.6306.4776.5280.785 S514.36814.051−2.256 3.4183.4741.6466.3306.3780.765 S614.63814.311−2.285 3.4633.5201.6536.4396.4880.765 S714.42214.093−2.334 3.4173.4731.6216.2976.3450.760 S814.34014.007−2.377 3.4363.4931.6626.3056.3530.765 S914.19113.862−2.373 3.3343.3841.5106.3026.3520.790 S1014.41214.088−2.300 3.3683.4211.5876.2316.2800.783 S1114.75314.417−2.331 3.4963.5551.6756.5426.5930.768 S1214.25013.900−2.518 3.5023.5611.6816.5476.5970.764 S1314.12913.798−2.399 3.4543.5131.7156.2946.3440.793 S1414.40314.077−2.316 3.3493.4011.5626.1706.2180.778 S1514.50914.191−2.241 3.3673.4201.5646.1426.1880.739

2.9 薄层色谱鉴别

取“2.3.4”项对照品溶液、“2.3.5”项供试品溶液和“2.3.6”项阴性样品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（20∶4.5∶0.5）为展开剂展开，取出，晾干，置于紫外灯（365 nm）下检视，结果见图3-A。再喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光和紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图3-B、C。

3 讨论

3.1 QAMS含量测定色谱条件考察

3.1.1 供试品溶液制备方法的考察 本实验考察了提取溶剂（水及20%、50%、80%甲醇），结果发现选择用50%甲醇作为提取溶剂，已提取完全，且峰型较好，基线也平稳，因此综合考虑，选用50%甲醇作为提取溶剂。超声时间（10、15、20 min），结果显示，10 min和15 min各共有峰峰面积无明显差异，说明超声10 min已经提取完全，因此超声时间定为10 min。

A-葛根成分显色图（紫外365 nm） B-甘草成分显色图（日光） C-甘草成分显色图（紫外365 nm） 1-葛根素对照品 2-甘草苷对照品 3-葛根阴性颗粒 4-甘草阴性颗粒 5-ZDG 2022071301 6-ZDG 2022071302 7-ZDG 2022071303 8-ZDG基准样品

3.1.2 流动相筛选 本实验考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同体系流动相，以ZDG中所测成分葛根素、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、甘草苷、甘草酸分离效果为指标，结果表明，乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相色谱峰峰型较好，各峰之间的分离度良好，基线较平稳，最终选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

3.1.3 检测波长的选择 本实验测定的化学成分种类较多，分别考察了220、254、280 nm波长下的样品谱图，通过比较分析在280 nm下的峰数目，峰形、分离度、对称因子、理论塔板数等参数，结果显示在280 nm波长下检测到的图谱出峰较多，基线平稳，峰形良好，且干扰少，故选择以280 nm作为含量测定波长。

3.1.4 内参物的选定 建立QAMS法，内参物的选定是关键，选定内参物的标准是易得、价廉、性质稳定、峰面积和保留时间稳定、供试品中的含量高[17-20]。在本实验研究的7个指标成分中，葛根素[15]为葛根异黄酮类中主要活性成分之一，且相较价廉易得，含量高、稳定性好，因此，本实验以葛根素为内标物，建立QAMS的分析方法，弥补了对照品不足或价格昂贵的缺点，也体现了QAMS法低成本的优势。

3.1.5s/i耐用性考察 采用2个不同品牌高效液相色谱仪和2种不同品牌色谱柱以及不同柱温和体积流量，分别考察了s/i和相对保留时间的可靠性，结果发现，不同仪器、不同色谱柱、不同柱温、不同体积流量下s/i的RSD均小于3.0%，相对保留时间的RSD均小于3.0%，说明该QAMS法的系统耐用性良好。

3.2 薄层鉴别条件考察

3.2.1 展开剂考察 分别以三氯甲烷-甲醇-水（20∶4.5∶0.5）（展开剂1）及环己烷-丙酮-醋酸乙酯（5∶2∶1）（展开剂2）为展开剂，展开，取出，晾干，展开系统2用氨水熏10 min，置紫外光灯（365 nm）下检视，后喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光和紫外光灯（365 nm）下检视。根据薄层色谱的分离情况，选择分离效果更好的展开系统1三氯甲烷-甲醇-水（20∶4.5∶0.5）作为ZDG同时鉴别葛根及甘草的薄层鉴别方法。

3.2.2 色谱条件稳定性考察 按上述确定的方法对薄层鉴别方法考察其稳定性，考察不同温度4、25 ℃及不同湿度25%、70%的影响。结果表明，与对照品、基准样品相应色谱位置上供试品色谱斑点颜色大小相同，且各考察因素下结果差异不大，温度及湿度对葛根及甘草薄层鉴别方法的影响较小。

3.2.3 不同厂家薄层板 按上述方法对葛根进行薄层鉴别，考察青岛海洋化工有限公司、青岛康业鑫有限公司、上海阿拉丁生化科技股份有限公司芯硅谷3个厂家生产的硅胶G板对竹茹汤中葛根及甘草薄层鉴别的影响。结果表明，与对照品、对照药材相应色谱位置上的供试品色谱斑点颜色大小相同，且各考察因素下结果差异不大，薄层板对葛根及甘草薄层鉴别方法的影响较小。

本研究首次建立了QAMS法结合特征图谱技术同时测定经典名方ZDG 7种成分的含量，同时建立薄层色谱法同时鉴别经典名方ZDG剂在质量控制鉴别中主要成分葛根素和甘草苷，此方法减少了薄层鉴别的工作量及试剂，并为经典名方薄层鉴别方法提供参考。15批样品特征图谱相似度均大于0.9；同时QAMS法和外标法分别测定15批ZDG 7种成分的含量结果无显著差异；薄层鉴别方法稳定性良好，特征图谱与QAMS联用的方法，可客观评价药效成分复杂的复方制剂的整体质量，以期为该制剂质量控制和评价提供科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Quality evaluation of Zhuru Decoction Granules based on quantitative analysis of multi-components with a single-marker content determination and TLC identification

HE Tian-yu1, MEI Xi1, WANG Xiao-li1, MAO Jing1, XIE Hui1, GUO Yong2, HOU Jin-cai2, LU Tu-lin1, MAO Chun-qin1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Shenwei Pharmaceutical Group Co., Ltd., Shijiazhuang 051430, China

To establish the characteristic chromatogram of Zhuru Decoction Granules (竹茹汤颗粒, ZDG) and determine its main components by quantitative analysis of multi-components with a single-marker (QAMS) method, optimize the TLC conditions, and establish a simultaneous identification method for puerarin and glycyrrhizin.To optimize and determine the best chromatographic conditions of HPLC and establish the characteristic chromatogram. With puerarin as the reference material, establish a QAMS for the identification of puerarin, 3′-hydroxypuerarin, 3′-methoxy puerarin, puerarin apigenide, daidzin, glycyrrhizin and glycyrrhizic acid, and establish the TLC conditions for the simultaneous identification of the main active ingredients puerarin and glycyrrhizin.The similarity between the characteristic profiles of the 15 batches of samples and their control profiles was greater than 0.95; There was no significant difference between the contents of the components obtained by the QAMS method and the external standard method for the 15 batches of preparations, and the relative errors of the seven components were less than 5%; The stability study proved that the thin-layer assay conditions were stable and feasible.The method is scientific, feasible, stable and controllable. The study is helpful to improve the quality control method of ZDG, a classic famous prescription, and is expected to provide a reference for the quality control evaluation of the classical prescription.

classical prescription; Zhuru Decoction; characteristic chromatogram; quantitative analysis multi-components by single marker; thin-layer chromatography identification; puerarin; liquiritin; 3′-hydroxy puerarin; 3′-methoxy puerarin; puerarin apioside; daidzin; glycyrrhizic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2023)14 - 4511 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.011

2022-12-13

国家重点研发计划项目（2018YFC1707000）

何天雨（2000—），硕士研究生，主要从事中药炮制及中药饮片质量标准研究。E-mail: 13844563203@163.com

毛春芹，正高级实验师，主要从事新药研发及中药质量究。E-mail: mcq63@163.com

[责任编辑 郑礼胜]