氧化苦参碱对棕榈酸诱导的人脐静脉内皮细胞胰岛素抵抗的作用及机制

王 莉，曾文靖，王超文，罗臻硕，黄起壬

• 药理与临床 •

氧化苦参碱对棕榈酸诱导的人脐静脉内皮细胞胰岛素抵抗的作用及机制

王 莉，曾文靖，王超文，罗臻硕，黄起壬*

南昌大学药学院，江西 南昌 330006

探讨氧化苦参碱（oxymatrine，OMT）对棕榈酸（palmitic acid，PA）诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）作用及机制。通过PA（0.25 mmol/L）诱导HUVECs建立IR模型后，进行OMT的量效关系和时效关系研究，筛选出OMT的最佳作用浓度和最佳作用时间。CCK-8法检测HUVECs活力；苏木素-伊红（HE）染色观察细胞形态；Western blotting检测细胞磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路、激活信号传导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白抑制因子1（protein inhibitor of activated STAT 1，PIAS1）蛋白表达；试剂盒检测一氧化氮（nitric oxide，NO）水平。根据筛选出的OMT最佳浓度（4 μmol/L）和作用时间（48 h），敲低PIAS1进行机制探讨，Western blotting检测PIAS1、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）蛋白表达；荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；ELISA法检测白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平；免疫荧光法观察NF-κB p65核转位情况。随着OMT作用浓度和时间的增加，PI3K/Akt/eNOS通路和PIAS1蛋白表达量及NO水平均增加（＜0.05、0.01、0.001）。转染Ad-PIAS1-RNAi后，NF-κB p65蛋白表达量、ROS和IL-6水平均显著增加（＜0.01、0.001），NF-κB p65入核程度显著增强（＜0.05、0.01），而OMT可以部分逆转上述作用（＜0.05、0.01、0.001）。OMT能改善PA体外诱导的血管内皮IR，其机制主要是通过上调PIAS1通路减轻高脂诱导的炎症反应和氧化应激。

氧化苦参碱；人脐静脉内皮细胞；棕榈酸；胰岛素抵抗；PIAS1；炎症反应；氧化应激

随着全球肥胖率的增加，胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）以及相关心血管疾病的患病率也在增加[1]。IR是肥胖和2型糖尿病的共同病理特征[2]。IR涉及多种分子和病理生理机制，是代谢紊乱、脂毒性、糖毒性和炎症等相互作用的结果[3]。血管内皮IR是肥胖并发血管疾病的始动环节，是滋生“代谢综合征”的共同“土壤”[4]。现在普遍认为IR也是一种慢性炎症过程，炎症导致IR的分子机制是近年研究的热点之一。

氧化苦参碱是从豆科植物苦参Ait.中提取分离得到的一种喹诺里西啶类生物碱，具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、心血管保护等多种药理作用[5-7]。研究表明，氧化苦参碱能够抑制同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞的凋亡，减轻内皮细胞功能障碍[8-9]，从而为氧化苦参碱在预防动脉粥样硬化中的作用提供了新的视角；然而，其确切的机制尚未完全阐明。激活信号传导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白抑制因子（protein inhibitor of activated STAT，PIAS）是一类活化的基因抑制蛋白。研究表明，PIAS1是一种E3连接酶，可以通过泛素化或类泛素化蛋白修饰依赖途径调控许多转录因子如Glis3的转录活性从而调节胰岛素信号[10]。已有研究表明氧化苦参碱可改善IR[11]，且可以调控肾小球细胞PIAS1蛋白表达[12]；同时课题组前期研究发现PIAS1可SUMO化修饰过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ），从而导致血管内皮IR[13]。由此推测氧化苦参碱可能通过调控PIAS1影响棕榈酸诱导的IR。因此，探明氧化苦参碱的这一作用将为IR相关心血管疾病的治疗奠定实验基础，对于降低糖尿病患者心脑血管事件发生、改善患者生存质量具有重要意义。

1 材料

1.1 细胞

人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）购自美国ATCC。

1.2 药品与试剂

氧化苦参碱（批号HY-NO158，质量分数≥98.0%）购自上海皓元生物医药科技有限公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培养基、苏木素-伊红（HE）染液购自北京Solarbio公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）试剂盒（批号A013-2-1）购自南京建成生物；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（批号2H-KMLJ201）购自南京卡米诺生物；荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（批号C1300-1）购自北京普利莱基因技术有限公司；Ad-PIAS1-RNAi病毒（批号133511D）购自上海吉凯生物；内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、PIAS1、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）抗体（批号分别为5880S、3550S、17366S）购自美国CST公司；PI3K抗体（批号PTM-5198）购自景杰生物；核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）抗体（批号00096033）购自武汉三鹰；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗体（批号334286）购自上海艾比玛特医药科技有限公司；Akt抗体（批号ET1607-73）购自杭州华安生物；山羊抗小鼠二抗（批号BST17E27C17F50）、山羊抗兔二抗（批号BST17G08A17G54）、β-actin抗体（批号18C03A27）购自武汉博士德生物。

1.3 仪器

SW-CJ-1F型超净工作台（苏州苏净安泰公司）；Forma311型CO2培养箱购自（美国Thermo Fisher Scientific公司）；8K43352型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；DYY-6C型垂直电泳-转膜系统（北京六一生物科技有限公司）；Enspire 680型酶标仪（美国Perkinelmer公司）；A1HD25型激光共聚焦显微镜（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 棕榈酸诱导血管内皮细胞IR模型的建立

参照文献方法[14-16]建立HUVECs IR模型。用0.25 mmol/L的棕榈酸作用于HUVECs 48 h，然后用胰岛素（100 nmol/L）处理30 min[17]。

2.2 CCK-8筛选药物安全范围

将HUVECs均匀接种于96孔板上，当细胞铺满培养板70%时使用梯度浓度（0、2、4、8、16、32 μmol/L）的氧化苦参碱对HUVECs处理48 h，通过CCK-8法检测细胞活力。

细胞活力＝(样品－校正)/(空白－校正)

2.3 氧化苦参碱最佳作用浓度和最佳孵育时间的确定

设置对照组、模型组和氧化苦参碱（2、4、8 μmol/L）组，除对照组外，其余各组用棕榈酸和不同浓度的氧化苦参碱处理48 h，最后用胰岛素（100 nmol/L）处理30 min，采用HE染色观察细胞形态，分别收集细胞培养液和细胞，检测细胞培养液中NO水平，检测细胞中PI3K/Akt/eNOS通路和PIAS1蛋白表达情况。

确定最佳作用浓度后，探究最佳作用时间。设置对照组、模型组和给药组，除对照组外，其余各组用棕榈酸处理48 h，给药组用4 μmol/L氧化苦参碱分别处理24、36、48 h，最后用胰岛素（100 nmol/L）处理30 min，收集细胞，检测细胞中PI3K/Akt/eNOS通路蛋白表达情况。

2.4 敲减PIAS1对氧化苦参碱改善棕榈酸诱导的HUVECs IR的影响

根据筛选出的氧化苦参碱最佳浓度（4 μmol/L）和作用时间（48 h），设置对照＋空载病毒组、棕榈酸＋空载病毒组、棕榈酸＋氧化苦参碱＋空载病毒组、对照＋siRNA-PIAS1[18]组、棕榈酸＋siRNA-PIAS1、棕榈酸＋氧化苦参碱＋siRNA-PIAS1组，含棕榈酸组均用0.25 mmol/L棕榈酸处理48 h，含氧化苦参碱组均用4 μmol/L氧化苦参碱处理48 h，转染组在进行棕榈酸和氧化苦参碱处理后，用无血清培养基分别转染48 h，检测细胞中PI3K/Akt/eNOS通路、PIAS1和NF-κB p65蛋白表达情况，检测细胞上清液中IL-6含量，检测细胞内ROS水平。

2.5 NO、IL-6水平的检测

按照试剂盒说明书检测NO和IL-6水平。

2.6 Western blotting检测蛋白表达

收集细胞，裂解提取蛋白，并测定总蛋白浓度。加入上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白变性，蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗（1∶1000），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜，加入二抗（1∶2000），室温孵育2 h，TBST洗膜，用ELC化学发光法进行显影，采用Image J软件分析。

2.7 HE染色观察细胞形态

细胞经过处理后，用PBS清洗干净，用苏木素染细胞核5 min，洗净加入伊红染细胞质1 min，在显微镜下观察形态并拍照。

2.8 激光共聚焦显微镜检测NF-κB p65亚细胞定位

将细胞均匀接种于激光共聚焦显微镜专用培养皿中。细胞经分组处理后，加入4%多聚甲醛固定细胞20 min，随后加入0.1% TritonX-100通透10 s，洗净后加入5%牛血清白蛋白，室温封闭2 h，然后加入NF-κB p65一抗（1∶800），4 ℃孵育过夜；次日加入荧光二抗（1∶400），室温孵育2 h，然后DAPI（1∶10）染核5 min，PBS洗净后在激光共聚焦显微镜下观察并拍照，利用Image J软件进行分析。

2.9 ROS水平检测

细胞经分组处理后，弃去培养基，用PBS冲洗细胞表面加入用无血清培养基稀释的DCFH-DA（1∶1000），培养箱孵育30 min，PBS清洗干净后，置于荧光倒置显微镜下观察，并计算各组相对荧光强度。

2.10 统计学分析

3 结果

3.1 氧化苦参碱对HUVECs活力、NO水平及细胞形态的影响

如图1-A所示，与对照组比较，2、4 μmol/L氧化苦参碱对HUVECs活力无明显影响，8 μmol/L氧化苦参碱对细胞活力有影响（＜0.05），16、32 μmol/L氧化苦参碱显著抑制细胞活力（＜0.01、0.001），具有一定的细胞毒性，因此确定药物的安全浓度范围0～8 μmol/L，选择2、4、8 μmol/L的氧化苦参碱进行后续实验。

如图1-B所示，与对照组比较，模型组上清液中NO水平显著降低（＜0.001）；与模型组比较，各给药组NO水平均显著升高（＜0.05、0.01、0.001），表明氧化苦参碱可以改善棕榈酸导致的NO分泌受阻。如图1-C所示，对照组细胞生长状态良好，细胞形态呈鹅卵石状且轮廓清晰，排列紧密，贴壁良好；模型组细胞生长停滞，细胞间隙增大，细胞皱缩变长失去原有形态；给予氧化苦参碱干预后，细胞逐渐恢复基本结构，细胞轮廓逐渐清晰，细胞间间隙明显缩小。

OMT-氧化苦参碱 与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下图同

3.2 不同浓度氧化苦参碱对棕榈酸诱导的HUVECs中PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达的影响

血管内皮细胞作为胰岛素作用的靶细胞，胰岛素可作用于血管内皮细胞膜上的胰岛素受体，进而通过PI3K/Akt/eNOS通路诱导NO的分泌。若出现IR，则会导致PI3K/Akt/eNOS通路传导障碍[19]。因此，考察了不同浓度氧化苦参碱对PI3K/Akt/eNOS通路蛋白表达的影响。如图2所示，与对照组比较，模型组PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达水平均显著降低（＜0.001），表明棕榈酸诱导的IR模型建立成功[20]。与模型组比较，各给药组细胞中PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达水平均显著升高（＜0.05、0.01、0.001），表明氧化苦参碱可改善棕榈酸诱导的PI3K/Akt/eNOS通路传导的障碍，且呈剂量相关性。

3.3 氧化苦参碱不同作用时间对棕榈酸诱导的HUVECs中PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达的影响

如图3所示，与模型组比较，氧化苦参碱处理24、36、48 h后PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达水平均显著升高（＜0.05、0.01、0.001）。表明氧化苦参碱呈时间相关性地改善棕榈酸诱导的该胰岛素信号通路传导的障碍。

图2 不同浓度氧化苦参碱对棕榈酸诱导的HUVECs中PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达的影响(, n = 3)

图3 氧化苦参碱不同作用时间对棕榈酸诱导的HUVECs中PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达的影响(, n = 3)

3.4 敲减PIAS1对氧化苦参碱改善IR的影响

如图4所示，与对照＋空载病毒组比较，棕榈酸＋空载病毒组PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达水平均显著降低（＜0.01、0.001）；与棕榈酸＋空载病毒组比较，棕榈酸＋氧化苦参碱＋空载病毒组PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达水平均明显升高（＜0.01），表明氧化苦参碱可对抗棕榈酸对PI3K/ Akt/eNOS通路的抑制作用，氧化苦参碱可改善棕榈酸诱导的IR。敲减PIAS1后，氧化苦参碱对IR的改善作用被部分消除，表明氧化苦参碱改善IR的作用至少部分是由PIAS1介导。

3.5 敲减PIAS1对PIAS1、NF-κB p65表达及IL-6水平的影响

由于PIAS1是JNK/STAT炎症应激通路的抑制蛋白，故首先研究了不同浓度的氧化苦参碱是否能上调PIAS1的表达来发挥抗炎作用。如图5所示，与对照组比较，模型组PIAS1蛋白表达水平显著下降（＜0.001）；与模型组比较，各给药组PIAS1蛋白表达水平均显著升高（＜0.05、0.01、0.001），呈剂量相关性，表明氧化苦参碱可以上调PIAS1表达。

为了探讨氧化苦参碱发挥抗炎作用是否依赖于PIAS1，设计针对PIAS1的siRNA来下调PIAS1。

与空载对应组别比较：&P＜0.05 &&P＜0.01 &&&P＜0.001，下图同

图5 PIAS1敲减对PIAS1、NF-κB p65表达及IL-6水平的影响(, n = 3)

结果显示，与空载组比较，siRNA组PIAS1蛋白表达水平显著降低（＜0.01），说明PIAS1成功沉默。本研究还探究了敲低PIAS1对NF-κB p65蛋白表达和IL-6水平的影响，结果显示，在PIAS1未敲减时，氧化苦参碱可逆转棕榈酸诱导的NF-κB p65表达和IL-6水平的增加（＜0.01），表明氧化苦参碱具有抗炎作用；在PIAS1敲减时，各组NF-κB p65表达和IL-6水平均较空载组显著增加（＜0.01、0.001），说明氧化苦参碱和PIAS1具有类似抗炎作用，且氧化苦参碱的抗炎作用可被PIAS1敲减部分逆转。

3.6 PIAS1敲减对NF-κB p65核移位的影响

NF-κB p65作为核转录因子，在正常情况下存在于细胞质中，而发生炎症反应时会转移入核。接下来探究了敲低PIAS1对NF-κB p65核移位的影响。如图6所示，在PIAS1未敲减时，氧化苦参碱可逆转棕榈酸诱导的NF-κB p65核移位（＜0.05），表明氧化苦参碱具有抑制NF-κB p65核移位作用；在PIAS1敲减时，各组细胞核内的NF-κB p65水平均较空载组显著增加（＜0.05、0.01），说明氧化苦参碱和PIAS1具有类似的抗NF-κB p65核移位作用，且氧化苦参碱的抗NF-κB p65核移位作用可被PIAS1敲减部分逆转。

图6 PIAS1敲减对NF-κB p65核移位的影响(, n = 3)

3.7 PIAS1敲减对ROS水平的影响

高脂血症常伴有氧化应激的增加。因此，探讨了PIAS1敲减对氧化应激的影响。如图7所示，在PIAS1未敲减时，氧化苦参碱可逆转棕榈酸诱导的ROS水平增加（＜0.01），表明氧化苦参碱具有抗氧化应激作用；在PIAS1敲减时，各组细胞内ROS水平均较空载组显著增加（＜0.01、0.001），说明氧化苦参碱和PIAS1具有类似的抗氧化应激作用，且氧化苦参碱的抗氧化应激作用可被PIAS1敲减部分逆转。

图7 PIAS1敲减对ROS水平的影响(, n = 3)

4 讨论

胰岛素抵抗是代谢综合征的关键组成部分，先于糖尿病、心血管疾病和阿尔茨海默病的发展。其病因途径尚不明确，但已建立许多促成机制[21]。近年来，有很多关于内皮细胞IR的研究，课题组前期已经证实高脂可以诱导内皮细胞IR[13]，因此，本研究基于课题组前期构建的细胞高脂模型进行研究，采用0.25 mmol/L的棕榈酸诱导HUVECs IR[19]，通过检测NO水平和PI3K/Akt/eNOS通路蛋白表达，证实此模型构建成功。

氧化苦参碱是一种天然生物活性化合物，具有改善IR的作用。研究发现，氧化苦参碱能够通过多种途径改善IR，如抑制p38的磷酸化来缓解肝脏中的氧化应激，调节肝脏KH型剪接调控蛋白（KH-type splicing regulatory protein，KSRP）、10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）和Akt表达，抑制炎症通路NF-κB p65蛋白表达，直接调节胰岛素PI3K/Akt/ eNOS通路，抑制炎症因子水平等[6-8,11,22-23]。本实验证实氧化苦参碱能够呈浓度和时间相关性改善棕榈酸诱导的HUVECs IR，主要机制是通过减少炎症因子IL-6的分泌、炎症标志性蛋白NF-κB p65的表达、氧化应激标志物ROS的生成以及抑制NF-κB p65核转位。相关研究表明，PIAS1缺乏通过激活NF-κB途径加重IR后心肌细胞凋亡和炎症反应[24]，过表达PIAS1会抑制炎症[25-26]。本研究发现，PIAS1敲减使HUVECs中总NF-κB p65含量显著上升，对其细胞核内含量影响大，这是由于在细胞核中PIAS1通过与p65的特异性结合充当NF-κB的负调节因子，PIAS1阻止NF-κB二聚体与DNA上的κB位点对接，从而严格控制NF-κB介导的基因表达[27]，后续应进一步分别观察胞质和胞核NF-κB p65蛋白的表达量。相关研究发现PIAS1的存在是对部分（17%～24%）基因进行ROS依赖性调节的要求[28]。作为基因抑制蛋白，PIAS1敲减使ROS水平上调；而加入氧化苦参碱干预后，上述PIAS1敲减的效应均能被显著逆转。表明氧化苦参碱调控PIAS1主要是通过抑制炎症反应和氧化应激。

综上，本研究主要通过棕榈酸建立IR模型，IR会引发炎症反应和氧化应激，导致细胞受损。通过氧化苦参碱干预治疗可以减轻炎症和氧化应激。氧化苦参碱也可以通过增加PIAS1蛋白表达减轻IR，这为防治糖尿病提供一条新的思路。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Effect and mechanism of oxymatrine on human umbilical vein endothelial cells insulin resistance induced by palmitic acid

WANG Li, ZENG Wen-jing, WANG Chao-wen, LUO Zhen-shuo, HUANG Qi-ren

College of Pharmacy, Nanchang University, Nanchang 330006, China

To explore the effect and mechanism of oxymatrine (OMT) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) insulin resistance (IR) induced by palmitic acid (PA).IR model was established by PA (0.25 mmol/L)-induced HUVECs. The dose-effect relationship and time-effect relationship of OMT were studied, and the optimal concentration and time of OMT were selected. The cell viability was examined by CCK-8. The cell morphology was observed by HE staining. The protein expressions of phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase (p-PI3K)/protein kinase B (Akt)/endothelial nitric oxide synthase (eNOS) pathway and protein inhibitor of activated STAT 1 (PIAS1) were detected by Western blotting. Nitric oxide (NO) level was detected by kit. According to the optimal concentration (4 μmol/L) of OMT and action time (48 h), the mechanism of knocking down PIAS1 was discussed. PIAS1 and nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65) protein expressions were determined by Western blotting. The generation of reactive oxygen species (ROS) was observed by fluorescence probe 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Interleukin-6 (IL-6) level was detected by ELISA. NF-κB p65 nuclear translocation was determined by immunofluorescence.The protein expressions of PI3K/Akt/eNOS pathway and PIAS1 and NO level were significantly increased with the concentration and treatment time of OMT increased (< 0.05, 0.01, 0.001). After infection with Ad-PIAS1-RNAi, NF-κB p65 protein expression and levels of ROS, IL6 were significantly increased (< 0.01, 0.001), and the NF-κB p65 nuclear translocation was significantly enhanced (< 0.05, 0.01). The above effects produced by Ad-PIAS1-RNAi were partially reversed by OMT intervention (< 0.05, 0.01, 0.001).OMT can improve IR by up-regulating PIAS1 pathway to alleviate the inflammation and oxidative stress induced by PA in vascular endothelium.

oxymatrine; human umbilical vein endothelial cells; palmitic acid; insulin resistance; PIAS1; inflammation; oxidative stress

R285.5

A

0253 - 2670(2023)14 - 4530 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.013

2023-03-01

国家自然科学基金资助项目（81960153）；南昌大学“大学生创新创业训练计划”项目（2022CX267）

王 莉（1999—），女，硕士研究生，研究方向为内分泌代谢性疾病药理学。E-mail: 2211292469@qq.com

黄起壬（1967—），男，教授，研究方向为内分泌代谢性疾病药理学。E-mail: qrhuang@ncu.edu.cn

[责任编辑 李亚楠]