新疆同域亚洲玉米螟和欧洲玉米螟发生与分布研究

丁新华　汪洋洲　贾尊尊等

关键词 亚洲玉米螟； 欧洲玉米螟； 近缘种； 种群分化； 寄主

中图分类号： Ｓ４５１ 文献标识码： Ａ DOI： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２２８６

玉米螟俗称玉米钻心虫，属鳞翅目Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ草螟科Ｃｒａｍｂｉｄａｅ秆野螟属Ostrinia，是世界范围内玉米上的主要害虫，每年给全球玉米生产造成巨大损失，同时也是造成中国玉米减产的第一大害虫［１３］。玉米螟在世界范围内主要分为欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis（Hubner）和亚洲玉米螟O.furnacalis（Ｇｕｅｎéｅ），其中欧洲玉米螟主要分布于欧洲、北非、西亚、中亚和北美洲［４５］，亚洲玉米螟则主要分布在亚洲东部和南部、澳大利亚和西太平洋的一些岛屿上［６］。中国是目前世界已知的唯一同时分布有亚洲玉米螟和欧洲玉米螟的国家，其中亚洲玉米螟在中国广泛分布且为绝对优势种，欧洲玉米螟目前已知仅分布于中国新疆的伊犁河谷地区［７］。

两种玉米螟同时也是研究生物进化、杂交和同域物种形成的理想模式生物［８９］，其中欧洲玉米螟由于种群间在生态和性特征上存在差异，已成为研究生态多样性和早期物种形成机制的模式生物［１０］。此外，同域发生区对种群进化研究也十分重要，已成为研究物种进化的热点之一［１１１３］。综上可见，同域发生的亚洲玉米螟和欧洲玉米螟可为研究近缘种种间竞争、物种进化、杂交等提供极为难得的材料。

新疆伊犁河谷地区地处我国最西部，与中亚的哈萨克斯坦接壤，并被青藏高原、塔克拉玛干沙漠和天山山脉阻隔。２０世纪８０年代新疆伊犁河谷地区还是纯系欧洲玉米螟分布区，亚洲玉米螟还没有入侵到此地，且欧洲玉米螟也没有入侵到亚洲东部，直到１９８８年之前该区域仅报道有欧洲玉米螟分布［１４１６］。但在近几十年里，亚洲玉米螟已入侵到这一区域，目前这一区域已成为世界上唯一一处已知的亚洲玉米螟和欧洲玉米螟同域混生区，且亚洲玉米螟作为外来种在玉米上已经成功取代欧洲玉米螟，成为混生区玉米上的优势种类，研究还发现亚洲玉米螟可以和欧洲玉米螟进行基因交流，并在自然界中发现了它们的大量杂交个体，且基因流偏向从亚洲玉米螟种群渗透到欧洲玉米螟种群［７］。

尽管新疆伊犁混生区玉米螟种群中欧洲玉米螟在玉米上的种群数量已显著下降，然而在混生区内其他寄主植物上欧洲玉米螟种群数量是否下降尚不清楚，且该混生区内玉米螟的主要野外寄主种类以及这两种近缘种在主要寄主植物上的群落组成及混生比例也尚不清楚，为此，本文在田间寄主植物系统调查的基础上，利用线粒体细胞色素ｃ氧化酶Ⅰ（ｍｔＣＯⅠ）基因测序和种特异性气味受体４（ＯＲ４）基因限制性酶切法对混生区内４个县市８个采样地５种主要寄主上的９８６个玉米螟样本进行种类鉴定分析，以期系统摸清新疆伊犁同域混生区内玉米螟的主要野外寄主种类，明确亚洲玉米螟和欧洲玉米螟的空间组成分布现状及不同寄主群落混生情况，为后续同域环境近缘种种间竞争、生物进化、杂交等研究提供基础数据。

１材料与方法

１．１寄主种类调查

笔者所在研究团队于２０１８年－２０１９年连续２年每年５月初至９月底对已有文献报道过是玉米螟寄主且在新疆伊犁河谷混生区内有广泛分布的植物开展玉米螟发生为害调查，共８科２１属２３种，同时还对这些寄主植物尤其是分布在玉米田周边可能是玉米螟野生寄主的杂草或其他植物开展系统调查。具体方法为：对每种主要寄主／可能寄主随机设置调查地，并重复３次，每调查样地均采用５点取样方法，每点２０株，每隔７ｄ调查１次，如若发现有玉米螟发生，则继续统计卵、幼虫、蛹等各虫期的数量和被害株率等指标。

１．２样本采集

本研究对混生区内玉米螟田间样本的采集分两次完成，第一批次样本采集于２０１９年８月３日至１６日，为混生区内玉米上采集的第２代玉米螟卵块，共获得９６１个卵块。随后在实验室内进行单卵块饲养，饲养条件为（２８±１）℃，光周期Ｌ∥Ｄ＝１６ｈ∥８ｈ，ＲＨ（７５±５）％，并對其中成功孵化的６０２个卵块进行抽样鉴定，每个卵块随机抽取单头低龄玉米螟幼虫进行ＤＮＡ 提取和物种鉴定（表１）。第二批次样本采集于２０１９年９月１３日至１０月７日，为混生区内５种主要寄主植物上采集的第２代玉米螟幼虫，共获得１２２５头样本。记录采样相关信息，将采集到的幼虫单头放入管帽扎有透气孔的１．５ｍＬ离心管内临时保存，带回实验室后置于－８０℃超低温冰箱中保存。随后从各采样地每种寄主上随机抽取一定数量的玉米螟幼虫进行ＤＮＡ 提取和物种鉴定，共计３８４头幼虫样本（表２）。综上，总计获得来自混生区内４个县市８个采样地５种寄主上的９８６个疑似玉米螟样本。

１．３DNA提取

玉米螟ＤＮＡ 的提取参考Ｆｒｏｈｌｉｃｈ等的方法略作修改［１７］。取单头玉米螟幼虫放入１．５ｍＬＥｐｐｅｎ-ｄｏｒｆ管内，吸取１０μＬ 裂解液［每升裂解液含５μＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ（ｐＨ＝８．０），１μＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０），５μＬＮＰ４０，５．３μＬ２５０．０ｍｇ／ｍＬＰｒｏ-ｔｅｉｎＫ＋ ，９８３．７μＬｄｄＨ２Ｏ］滴在虫体上，使用灭菌的小号研磨棒将玉米螟充分研磨均匀；用１０μＬ裂解液清洗研磨棒并将清洗液移入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，最后再加入４０μＬ裂解液（总体积约６０μＬ）；将匀浆液在ＰＣＲ仪中温育（６５℃１５ｍｉｎ，９５℃１０ｍｉｎ），温育后的产物在－２０℃贮存备用。

１．４PCR扩增

ＰＣＲ反应总体系为５０μＬ，其中ＤＮＡ 模板２．４μＬ，上、下游引物（线粒体COI基因，ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＧＵ０９３５２２．１。上游：５′-ＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣ-ＧＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡ-３′；下游：５′-ＴＡＡＡＣＴＴＣＴＧ-ＧＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡ-３′）各２ μＬ，TaqＰＣＲｍｉｘ２５μＬ，其余使用超纯水补足。ＰＣＲ 反应程序为９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５２℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃ １０ｍｉｎ；４℃ 保存。ＰＣＲ 产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果在ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒＨＰ凝胶成像系统中检查。将ＰＣＲ产物送至深圳华大基因公司，对９８６个玉米螟样品的单链进行测序（ＡＢＩ３７３０Ｘｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。

１．５物种鉴定

对样品的mtCOⅠ基因序列进行比对，并结合气味受体４（ＯＲ４）基因限制性内切酶酶切的结果鉴定亚洲玉米螟和欧洲玉米螟杂合体组成情况［７］。首先，将COⅠ序列在ＢＯＬＤ数据库在线比对确认玉米螟种类［１８］，并将相关序列提交至ＧｅｎＢａｎｋ，其中９４２ 个亚洲玉米螟序列ＧｅｎＢａｎｋ 登录号为ＯＮ４２８４６９～ ＯＮ４２８４７６、ＯＮ４２８６８０～ ＯＮ４２８９００、ＯＮ４５３５３２～ ＯＮ４５３６１４、ＯＮ４５３６１６～ ＯＮ４５３６４５、ＯＮ４５８７６１～ ＯＮ４５８８００、ＯＮ４５８８０２～ ＯＮ４５８８５８、ＯＮ４６０５９７～ ＯＮ４６０６４６、ＯＮ４６０９５４～ ＯＮ４６１００３、ＯＮ４６１２５７～ ＯＮ４６１３６７、ＯＮ４６１３７７～ ＯＮ４６１４７２、ＯＮ４６２１８５～ ＯＮ４６２２５８、ＯＮ４６８５２３～ ＯＮ４６８５２７、ＯＮ４６８５３１～ＯＮ４６８５６０、ＯＮ４６８５６３～ＯＮ４６８６４５；４４个欧洲玉米螟序列ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＯＮ４６２３６８～ＯＮ４６２４１１。

OR４基因获取及酶切：ＰＣＲ反应总体系为５０μＬ，其中ＤＮＡ 模板２．４μＬ，上、下游引物（ＯｓｔＯＲ４-Ｆ１：５′-ＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＴＣＧＡＣＴＣＴ-３′；ＯｓｔＯＲ４-Ｒ１：５′-ＴＴＧＴＣＧＧＡＡＡＧＧＴＡＡＴＲＴＡＧＣＣ-３′）各２ μＬ，TaqＰＣＲｍｉｘ２５μＬ，使用超纯水补足至５０μＬ。ＰＣＲ反应程序：９４℃ ５ ｍｉｎ；９４℃ ３０ｓ，５７℃ ３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃ １０ｍｉｎ，４℃ 保存。ＰＣＲ产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物用TaqⅠ进行酶切，酶切体系包括ＰＣＲ产物１０μＬ （０．１～０．５μｇ的ＤＮＡ），ｎｕｃｌｅａｓｅ-ｆｒｅｅｗａｔｅｒ１８μＬ，１０×TaqⅠＢｕｆｆｅｒ２μＬ，TaqⅠ１～２μＬ。混匀后在６５℃温浴１～１６ｈ，消化样品用３％琼脂糖凝胶在８０Ｖ下电泳６０ｍｉｎ，然后在凝胶成像系统中检查结果。

１．６数据分析

采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ２０１０和ＳＰＳＳ２３．０统计软件对混生区内不同调查地点亚洲玉米螟或欧洲玉米螟卵块／幼虫混生比例间的差异水平进行单因素方差分析（ＯｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ），如果差异显著再进行Ｄｕｎｃａｎ’ｓＨＳＤ 多重比较，显著性水平设定为α＝０．０５。

２结果与分析

２．１新疆伊犁同域混生区玉米螟主要寄主植物种类调查

调查发现，新疆伊犁混生区内玉米螟的寄主植物主要是玉米Zea ma ys L、高粱Sorghum bicotor（L.）Ｍｏｅｎｃｈ、稗Echinochloacrus-galli（L.）Ｂｅａｕｖ．、狗尾草Setaria viridis（L.）Ｂｅａｕｖ．和苘麻Abutilon theo phrasti Medicus ，偶見苍耳Xanthium strumarium L.、大麻Cannabis sativa L、反枝苋Amaranthus rdroflerus L.等，其中，玉米为该混生区玉米螟最主要的寄主，受害最严重，平均虫量为３０～２４０头／百秆，严重时高达５６０头／百秆。其次为高粱，平均虫量为１０～４０头／百秆。在混生区调查地可见玉米螟在稗草上普遍发生，平均被害株率可达１０％～２０％。狗尾草、苘麻等杂草也常见玉米螟不同程度地发生，被害株率除在极少数区域可达１％～５％以外，大多低于１％。此外，混生区内也偶见苍耳、大麻、反枝苋上有少量玉米螟幼虫，豇豆、茄子有极少量玉米螟卵块分布但未见幼虫发生。

２．２新疆伊犁同域混生区玉米植株上两种玉米螟卵组成和分布情况

在明确混生区主要寄主植物种类的基础上，首先对混生区内主要寄主植物玉米植株上两种玉米螟卵的组成及混生情况进行研究，从玉米植株上采集的第２代玉米螟卵块中有３５９个卵块因被赤眼蜂寄生、卵块干燥死亡、无效卵等原因未能孵化，对成功孵化的６０２个卵块进行单卵块饲养并依次抽取低龄幼虫进行COⅠ片段测序，并在ＢＯＬＤ 数据库搜索比对，结果显示，５７５个卵块样本被鉴定为亚洲玉米螟，相似性为９９．０２％～１００％；２７个卵块样本则被鉴定为欧洲玉米螟，相似性为９９．２４％～１００％。从地理分布来看，亚洲玉米螟已在混生区内所有调查县市的玉米上广泛分布，且在各调查地混生比例存在显著差异（犘＜０．０５），为８６．４４％～１００％不等；欧洲玉米螟分布范围已经极为有限，仅分布于紧邻哈萨克斯坦的霍尔果斯市以及位于伊犁河谷最东部、西天山腹地新源县这２个县市的少数区域，且所占比例较低，为０～１３．５６％不等。所有调查地中，新源县塔勒德镇欧洲玉米螟比例最高，达１３．５６％，其次依次为新源县阿勒玛勒镇（１１．２５％）、霍尔果斯市伊车乡（９．５５％）、新源县阿热勒托别镇（０．６４％）。新源县吐尔根乡和霍城县均未发现有欧洲玉米螟分布。

２．３新疆伊犁同域混生区不同寄主植物上玉米螟幼虫的种类组成和分布情况

为进一步摸清混生区内各主要寄主植物上分布的玉米螟种类组成及混生情况，笔者采集了混生区内５种主要寄主植物上的第２代玉米螟幼虫，共获得１２２５头样本，并随机抽取一定数量的样本进行mtCOⅠ基因片段测序，并在ＢＯＬＤ 数据库中在线比对，结果显示，３６７个幼虫样本被鉴定为亚洲玉米螟，相似性为９９．１１％～１００％；１７个幼虫样本被鉴定为欧洲玉米螟，相似性为１００％。从不同寄主分布来看，亚洲玉米螟比欧洲玉米螟有更广泛的寄主范围和更强的竞争力，具体表现为亚洲玉米螟在混生区内可取食玉米、高粱、稗草、狗尾草、苘麻等所有主要寄主植物，其在上述５种寄主上的混生比例依次为７３．３３％ ～１００％、１００％、８８．８９％ ～１００％、９５．００％～１００％、１００％。欧洲玉米螟则主要集中分布在玉米上，混生比例为０～２６．６７％，偶尔取食稗草和狗尾草，混生比例依次为０～１１．１１％、０～５．００％不等。综合来看，目前亚洲玉米螟已在混生区内所有主要寄主植物上成功取代欧洲玉米螟，并成为新疆伊犁同域混生区内的绝对优势种。

２．４新疆伊犁同域混生区两种近缘种玉米螟杂交个体组成情况

我们在玉米mtCOⅠ基因测序比对的基础上，采用OR４基因限制性内切酶鉴定法对上述５种主要寄主植物上的３８４头玉米螟幼虫样本进行酶切鉴定。结果（图１）显示，３６７头幼虫样本酶切结果为两条带，即存在TaqⅠ酶切位点（ＴＣＧＡ），被鉴定为亚洲玉米螟；１７头幼虫样本酶切结果为１条带，即不存在TaqⅠ酶切位点（ＴＣＧＡ），被鉴定为欧洲玉米螟。综合mtCOⅠ和OR４基因的联合鉴定结果，上述所有玉米螟样本两种鉴定方法的结果均保持一致。这表明，本研究中混生区内５个研究地５种寄主植物上分布的３８４头玉米螟样本均为纯合体，即纯合亚洲玉米螟和纯合欧洲玉米螟，未发现有杂合体存在。

３结论与讨论

欧洲玉米螟是一种多食性鳞翅目昆虫，原产于欧洲和西亚［１９］，其幼蟲可以取食２００多种单子叶和双子叶寄主植物［１０］，有证据表明，其在地方栽培玉米和其他寄主植物上呈现一定程度的专化性［２０］。如Ｍａｌａｕｓａ等［９，２１］研究发现，法国北部取食玉米和啤酒花艾蒿的欧洲玉米螟种群分化为２种寄主型，而其他地区未发现明显的寄主专化型。实验室选择性试验表明，欧洲玉米螟初孵幼虫可能更喜欢替代宿主杂草而不是玉米［２２］，但在玉米上的存活率最高［２３２４］。在波兰和其他欧洲国家，欧洲玉米螟主要在北艾Artemisia vulgaris、啤酒花Humulus lupu-lus、大麻Cannabis sativa和玉米上被发现［２］。本研究发现，目前新疆伊犁混生区内欧洲玉米螟主要取食并分布在玉米上，偶见取食稗草、狗尾草，其在上述３种当地主要寄主植物上的混生比例依次为０～２６．６７％、０～１１．１１％、０～５．００％。这与Ｍｅｇａｎ等通过利用稳定同位素（δＣ）发现北美地区欧洲玉米螟主要取食Ｃ４植物（主要是玉米）的研究结果基本一致［２０］，但与Ｐｉｗｃｚｙńｓｋｉ等的研究结果不同［２］。从地理分布来看，新疆伊犁混生区内欧洲玉米螟分布范围极为有限，目前主要分布在伊犁河谷最西部，与中亚哈萨克斯坦毗邻的霍尔果斯市以及位于伊犁河谷最东部，西天山腹地新源县等少数区域，所占比例仅为０～２６．６７％不等。

亚洲玉米螟被认为是中国广布的优势种，我国已明确的亚洲玉米螟寄主植物也有７０余种，可为害玉米、高粱、谷子、水稻等重要粮食作物以及棉、麻等经济作物和多种菊科类杂草［２５２６］。本研究发现，亚洲玉米螟在新疆伊犁混生区所有调查县市的采样地均广泛分布，所占比例为７３．３３％～１００％，从寄主分布来看，混生区内玉米、高粱、稗草、狗尾草、苘麻等５种寄主植物上的玉米螟种类也均主要是亚洲玉米螟，比例依次为７３．３３％～１００％、１００％、８８．８９％～１００％、９５．００％～１００％、１００％。目前，亚洲玉米螟已在混生区内主要寄主植物上成功取代了欧洲玉米螟，成为新疆伊犁同域混生区内的绝对优势种，且广泛分布于各混生区内。这一研究结果与王克勤等［２７］、杨哲等［２８］对我国东北地区亚洲玉米螟寄主专化性分析的主要结果基本相符。田间试验发现酸模叶蓼Persicaria lapathifolia是亚洲玉米螟最适宜寄主植物，其次为玉米、谷子、薏苡Coix lacryma-jobi［２５，２８］。混生区内亚洲玉米螟比欧洲玉米螟具有更广泛寄主范围的原因可能是由于亚洲玉米螟在玉米引入中国之前就以谷子和杂草为寄主，在中国进化的历史比较悠久，因而比欧洲玉米螟具有更强的竞争力。

此外，笔者利用mtCOⅠ基因测序结合气味受体４（OR４）基因酶切鉴定对混生区内不同调查地玉米、高粱、稗草、狗尾草、苘麻等５种寄主植物上亚洲玉米螟和欧洲玉米螟的杂合体组成情况进行分析，所有３８４个玉米螟样本均为纯合亚洲玉米螟或纯合欧洲玉米螟，未发现有杂合体存在。这一结果与Ｗａｎｇ等［７］的研究结果存在差异，推测造成这一差异的原因可能有两个，一方面Ｗａｎｇ等［７］主要是采用６４ 个高通量ＳＮＰ遗传位点标记和一个种特异性气味受体犗犚４ 基因证明了自然界中亚洲玉米螟和欧洲玉米螟杂交个体的存在，而本文采用的犿狋犆犗Ⅰ基因测序结合气味受体犗犚４基因酶切鉴定的方法可能不能准确地发现杂合体的存在。另一方面，也有可能是由于在亚洲玉米螟加速取代欧洲玉米螟过程中受遗传漂变的影响导致杂合体比例快速降低，其具体原因有待日后进一步深入研究。本文通过全面摸清当前新疆伊犁这一世界上唯一已知亚洲玉米螟和欧洲玉米螟同域混生区域内玉米螟种群竞争替代以及主要寄主种类，系统明确亚、欧两种玉米螟在主要寄主植物上的分布情况，为后续同域环境近缘种种间竞争替代和生物进化等研究提供科学依据。