基于非靶向代谢组学探讨射干麻黄汤治疗哮喘的作用机制

韩雨晴 李星星 郭文军 张洪铭 孙元鹤 解生旭 席中原 徐雅娟

(1长春中医药大学,吉林 长春 130117;2吉林省中医药科学院中药药效物质基础重点实验室)

哮喘又称支气管哮喘,由基因和环境共同作用,是一种慢性炎症疾病,在全球影响约3亿人〔1〕。哮喘中老年人约占13%,发病率和死亡率相对较高,严重影响老年人的生活质量〔2〕。目前治疗药物主要分为皮质类固醇、β2受体激动剂、白三烯受体拮抗剂、过敏原免疫疗法等,尽管它们可以控制症状,但不能影响疾病的进程,伴有依从性、耐受性差、副作用等不良影响〔3,4〕。在中医中哮喘属于哮病,为外邪侵犯机体,表邪不去,邪阻于肺,气机不畅,气不布津,聚集成痰。中医药在治疗哮喘中疗效确切、副作用小,更适合于老年人〔5～7〕。《金匮要略》中提出哮病的治疗方法,如“咳而上气,喉中水鸡声,射干麻黄汤主之。”射干麻黄汤为经典名方,由射干、麻黄、细辛、生姜、大枣、紫菀、半夏、五味子、款冬花组成,主要治疗寒饮郁肺所致的咳喘证,具有祛痰抗炎的功效〔8〕。在临床上可以缓解哮喘症状,改善呼吸功能,且安全性好〔9,10〕。本研究建立卵清白蛋白致大鼠哮喘模型,评价射干麻黄汤(SMD)治疗哮喘的疗效,基于液质(LC-MS)的非靶向代谢组学技术研究SMD治疗哮喘的作用机制。

1 材料与方法

1.1动物、试剂与仪器 动物:72只SPF级SD雄性大鼠,体质量150～170 g,平均(160±10)g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,生产许可证号:SCXK(辽)2020-0001。质量合格证号:2107262-10100133882。药物与试剂:卵清白蛋白,Sigma公司产品北京鼎国昌盛生物技术有限公司分装,批号:BOBM10210V。氢氧化铝,Sigma公司产品,批号:MKCM1237。灭活百日咳杆菌抗原,冻干粉,纯度>95%,爱必信(上海)生物科技有限公司,货号:abs03015。C反应蛋白(CRP)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒,上海沪峰化工有限公司。醋酸地塞米松片,安徽金太阳生化药业有限公司,产品批号:2007222。仪器:Vanquish Duo 超高效液相色谱仪、Q-Ecactive 质谱仪(美国Thermo Fisher Science);GL-21M 高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);DNM-9602型酶标仪(北京普朗新技术有限公司);ZT-14V2生物组织脱水机(孝感市亚光医用电子技术有限公司);RM2255切片机(德国Leica公司);YR-21苏木素-伊红(HE)染色机(孝感市亚光医用电子技术有限公司);YB-6LF包埋机(孝感市亚光医用电子技术有限公司);YT-7FB摊片机(孝感市亚光医用电子技术有限公司);BX51显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.2SMD的制备 SMD由细辛、紫菀、麻黄、射干、半夏、五味子、款冬花、生姜和大枣组成。准确称量粉碎的药材,然后用1∶25(W/V)的沸水煎煮2次,1.5 h/次。用纱布过滤后,合并滤液,在70 ℃的真空蒸发器中浓缩。最后,滤液浓缩为1.743 g原药材/g提取物。

1.3动物分组、造模与给药 经过7 d的适应期,所有大鼠被随机分成:对照(NC)组、模型(OVA)组、地塞米松(Dex,0.75 mg/kg)组、低剂量SMD治疗(SMD-L,3.275 g/kg)组、中剂量SMD治疗(SMD-M,6.55 g/kg)组、高剂量SMD治疗(SMD-H,13.1 g/kg)组各12只。采用体内注射卵清白蛋白法建立大鼠过敏性哮喘模型。除NC组外所有大鼠在第1天和第8天每只多点注射(四肢内侧皮下、腹腔各0.2 ml)致敏液1 ml〔1 ml致敏液含10 mg卵清白蛋白和100 mg氢氧化铝,由磷酸盐缓冲液(PBS)溶解〕,同时腹腔注射灭活百日咳杆菌抗原1 ml(1支抗原用PBS定容至100 ml)。从第15天开始,除NC组外,其余大鼠每天接受2%卵清白蛋白雾化,持续2 w。NC组在第1天和第8天腹腔注射PBS,然后在第15天用PBS进行雾化,持续2 w。地塞米松和SMD治疗组的动物从第15天起在卵清白蛋白雾化前1 h口服地塞米松和SMD,1次/d,共14 d。NC组和OVA组用相同体积的蒸馏水灌胃。

1.4样本收集与制备 各组大鼠在末次激发2 h后,腹主动脉采血,室温静置1 h后,3 000 r/min离心10 min取血清,用ELISA检测血清中CRP的含量。取左叶肺放入4%甲醛溶液中,用于HE染色。于末次激发后,每只大鼠灌胃蒸馏水8 ml,放入代谢笼中,接尿2 h,放置于-80 ℃冰箱储存。根据药效结果综合评定,以SMD-M组进行代谢组学研究。将储存的冷冻尿液样本在4 ℃解冻,在使用前混合均匀。取200 μl尿样,以15 000 r/min 在4 ℃离心10 min,取100 μl上清液,加入100 μl水,混合均匀,用于LC-MS分析。使用上述方法制备尿液质控样本(QC),以优化色谱和质谱条件及方法验证。

1.5生化指标检测 使用ELISA检测血清CRP含量。取4%甲醛溶液中左叶肺,固定后常规脱水,石蜡包埋,切片,HE染色,显微镜观察组织变化。

1.6色谱及质谱条件 使用Vanquish Duo超高效液相色谱仪和Q Exactive质谱仪对尿液样品的代谢情况进行分析。色谱柱:Hypersil GOLD柱(2.1 mm×50 mm,1.9 μm),柱温:50 ℃,进样量:2 μl。流动相由含0.1%甲酸的水(A相)和乙腈(B相)组成,以0.4 ml/min的速度进行梯度操作: 0.5%B(0～1 min),0.5%→1%B(1～2 min),1%→5%B(2～3 min),5%→15%B(3～8 min),15%→50%B(8～10 min),50%→95%B(10～12 min),95%→0.5%B(12～13 min),0.5%B(13～18 min)。

色谱分离后,被注入Q-Orbitrap MS。数据采集分别在正离子和负离子模式下操作。全扫描分析中质量范围被设定为100～1 500 m/z,分辨率为35 000。二级的分辨率为17 500,使用数据依赖性(ddMS2 Top 15)采集获得的。ESI源参数设置如下:毛细管电压设置为正离子模式3.8 kV、负离子模式-3.5 kV,鞘内气体流量为60 arb,辅助气体流量为15 arb,毛细管温度为300 ℃。

1.7数据处理 将原始谱图导入Compound Discoverer3.1软件中进行色谱峰的提取、标准化等处理。将数据导入到SIMCA-P14.1 软件进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA),以投影值(VIP)>1.8进行初步筛选。将筛选出来的数据导入到MetaboAnalyst 5.0 以差异倍数(fold-change)>1.5或<0.66和P<0.05筛选差异代谢物。根据HMDB和Compound Discoverer数据库结合二级碎片离子对其进行鉴定指认。使用OECloud tools进行聚类分析,观察差异代谢物的变化趋势。被SMD逆转的差异代谢输入到MetaboAnalyst5.0进行通路富集分析。

2 结 果

2.1生化指标结果 对肺组织进行HE染色,NC组肺组织有完整的支气管黏膜上皮和黏膜肌层,支气管腔规则,无腺体增生,炎症细胞浸润少。OVA组肺组织显示炎症细胞严重浸润至血管周围和结缔组织,管腔变窄,黏膜增厚。Dex和SMD治疗明显减弱了造模引起的病理变化,见图1。与NC组〔(8.43±0.84)μg/ml〕相比,OVA组血清中CRP含量〔(10.11±1.41)μg/ml〕明显升高(P<0.01)。与OVA组相比,Dex组〔(8.62±0.75)μg/ml〕、SMD-H组〔(8.09±0.48)μg/ml〕、SMD-M组〔(8.31±1.03)μg/ml)〕、SMD-L组血清中CRP含量〔(8.52±0.88)μg/ml〕明显降低(均P<0.01)。

2.2多元统计学分析 为了确定样本分析时的稳定性,获得可以重复的代谢产物,每10针检测1次QC,对QC样品进行主成分分析(图2)。QC相聚在一起,表明仪器稳定性良好,获得的数据可信赖。

A为正离子模式,B为负离子模式图2 QC的PCA得分

对NC组和OVA组进行PLS-DA分析,两组间主成分显著分开,表明造模后发生了代谢紊乱。经SMD-M治疗后,紊乱的代谢物得到纠正(图3)。

A和C为正离子模式,B和D为负离子模式图3 3组尿液PLS-DA得分

2.3差异代谢物的鉴定 经非靶向分析,造模后尿液样本共筛选和鉴定出29个差异代谢物,其中21个被SMD-M逆转调节,见表1。采用聚类分析法对差异代谢物进行分析,直观地展现差异代谢的变化趋势,见图4。

表1 尿液的差异代谢物

图4 尿液差异代谢物的聚类分析热图

2.4代谢通路分析 将SMD-M组逆转调节的差异代谢物导入MetaboAnalyst5.0进行通路富集分析,得到主要的通路为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,酪氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,泛醌和其他萜类醌生物合成,苯丙氨酸代谢,见图5。

图5 通路气泡

3 讨 论

本研究证明,SMD具有抗哮喘作用。对尿液进行代谢组学分析,进一步确定SMD的疗效。CRP是急性反应蛋白之一,血清CRP增加与哮喘严重程度呈正相关,是评价哮喘状态的合理依据〔11〕。这与本研究结果相一致,表明SMD可以减轻肺部炎症,发挥作用。

在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、酪氨酸代谢和苯丙氨酸代谢的3条通路中,酪氨酸由苯丙氨酸在体内羟基化产生,是合成激素的重要原料,酪氨酸水平降低,减少激素合成,进而影响哮喘〔12〕。据报道,L-酪氨酸的微生物代谢对过敏性气道炎症具有保护作用,其肠道代谢物-甲酚硫酸盐选择性地减少气道上皮细胞产生的趋化因子配体20,保护宿主免受过敏性气道炎症〔13〕。造模后酪氨酸含量降低,导致激素合成的减少,给药后酪氨酸含量增加,表明SMD可能通过增加激素合成和减少气道炎症发挥作用。

牛磺酸可代谢为5-L-谷氨酰-牛磺酸,牛磺酸为广泛存在于哺乳动物体内的β自由氨基酸,具有膜稳定、维持细胞内外渗透压的平衡、抗炎等作用,是一种细胞保护剂。通过监测牛磺酸对哮喘豚鼠气道炎症的影响,发现其可以减少嗜酸性粒细胞的聚集〔14〕,也有研究表现,牛磺酸可以通过抑制Toll样受体(TLR)-4/核因子(NF)-κB途径,减轻肺部炎症〔15〕。同时临床上哮喘患者给予牛磺酸片后,其抑制炎症介质的释放,缓解了哮喘患者的临床症状〔16〕。在代谢组学结果中表明5-L-谷氨酰-牛磺酸造模后含量降低,这与文献〔17〕报道哮喘患者血清游离氨基酸谱中结果一致,经SMD给药后其水平得到调节,进而起到平喘的作用。推测SMD可能通过抑制TLR-4/NF-κB途径发挥治疗哮喘的作用,这为后续研究提供了新的方向。

综上,SMD可降低哮喘大鼠的CRP含量,改善肺组织状态,并通过逆转L-酪氨酸、5-L-谷氨酰-牛磺酸、20-氧代-白三烯B4等代谢产物,调节酪氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢,起到平喘的效果。