例谈高中生物学常考的几种PCR扩增技术

沈 舰 纪 磊 何 亮

(1.湖北省十堰市教育科学研究院 2.湖北省十堰市一中 3.湖北省襄阳市一中)

随着生物技术的飞速发展,曾经遥不可及的PCR技术逐步走进了高中实验室,甚至进入到寻常百姓家。考题中有关PCR的问题越来越多,设问考查深度也明显提升。笔者在走访调研中发现,零碎的试题讲解效果有限,既无法让学生系统掌握不同PCR技术的用途,也无法切实提升学生的关键能力和探究素养。下面笔者将结合高中生物学常考的PCR类试题,浅谈六类PCR扩增技术,为教学提供参考。

1.常规PCR

人教版教材中介绍的就是常规PCR流程。在PCR仪中通常要加入7种成分:模板DNA片段、引物、脱氧核苷酸底物、Taq酶、酶所需缓冲液、Mg2+和纯净水。在此提示几点注意事项:一是引物的长度一般在16 bp以上,以避免其与模板配对时的非特异性结合。但引物越长,需要测定的模板DNA序列越多,制作引物的成本越高,所以18～30 bp是较为理想的长度。二是引物中G+C的含量要尽量控制在40%～60%,这样可以保证较高的退火温度,3′末端要尽量避免T(引物末尾碱基是T时错配的概率远大于其他3种)。三是缓冲液中需要添加Mg2+来激活Taq酶的活性中心。

常规PCR的相应例题较为普遍,在此不再赘列。

2.反向PCR

反向PCR多用于扩增的DNA分子中仅部分序列已知,其扩增的思路:先利用多种限制酶对待测DNA片段进行随机切割,再利用DNA连接酶对片段进行环化。随后在已知序列的两个末端设计引物,进而来扩增已知序列两侧的未知序列。以2022年浙江省某模拟题为例:

例1.反向PCR可利用一段已知DNA序列设计合理的引物,扩增已知序列两端的未知序列,如图1所示。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“5′-AACTATGCGCTCATGA-……-GCAATGCGTAGCCTCT-3′”。下列叙述错误的是

图1 反向PCR流程图

( )

A.Ⅰ酶切:用一种限制酶切割DNA,以使两端未知序列形成相同的黏性末端

B.Ⅱ连接:使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键

C.设计的两种引物分别是“5′-AACTAT GCGCTCATGA-3′”和“5′-AGAGGCTACGCAT TGC-3′”

D.对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列,该DNA单链序列可能为“5′-AATTC CAGT-……-CTGAATT-3′”

答案：C。两种引物需与已知序列发生互补配对,而后向两侧延伸合成未知序列。

反向PCR在基因序列鉴定过程中具有独到优势,但也存在一些限制条件:一是必须选择一种合适的限制酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。二是若使用的引物含有待测DNA的某些重复序列,反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

3.多重PCR

多重PCR(MPCR)在高中生物学考题中出现的频率非常高,顾名思义就是在同一反应体系中使用一对以上的引物对同一DNA分子进行扩增,不同引物结合的位置不同,扩增的产物也有差异。通过比较扩增产物的大小差异即可判断样品中有哪些基因。比较典型的是2022年湖南省生物联赛初赛的一道题:

例2.随着科学技术的发展,MPCR技术在扩增方面取得新的突破,不再局限于在同一反应管中进行扩增,而是将不同的引物对和模板分散于相应独立的空间中进行扩增。下列相关叙述错误的是

( )

A.对于同一DNA片段的不同区段进行扩增时,不同引物的碱基排列顺序不能互补

B.同一反应体系中扩增不同模板时需加入更多TaqDNA聚合酶才能使扩增正常进行

C.在目的DNA片段扩增时,若复性阶段温度控制过高,可能导致无产物

D.PCR扩增DNA时打开双螺旋的方式与细胞内不同,实质都是磷酸二酯键断裂

答案：D。PCR扩增时打开的是DNA的氢键,与细胞内打开方式不同,但作用的化学键相同,D错误。

多重PCR最大的缺陷是由于扩增产物不同,扩增多次后形成二聚体和多聚体的概率逐步增大,导致非特异性扩增大幅上升。

4.巢式PCR

巢式PCR先用待扩增DNA外侧的一对引物完成一次PCR,再将其作为模板,根据原来引物内侧的序列设置新的引物,再次完成第二次PCR。由于第二次PCR的模板DNA片段更短,引物更小,因此可以减少第一次扩增中出现的非特异性扩增片段,提升扩增的精确性。但由于操作过程中的开盖处理,会增加产物污染的概率。以2022年扬州三模22题的一部分为例:

例3.图2是巢式PCR工作原理示意图,请回答:

图2 巢式PCR示意图

(1)若用外引物扩增产生了错误片段,再用内引物在错误片段上进行引物配对并扩增的概率________,因此,相较常规PCR获得的产物而言,巢式PCR获得产物特异性________。

(2)巢式PCR通常在一个试管中进行第一阶段反应,然后将中间产物等转移到第二试管中进行第二阶段反应,不在同一试管中进行的主要原因是________。

答案：(1)降低 更强 (2)防止内引物在第一阶段PCR中发挥作用,无法实现巢式PCR高精确扩增的目的

对比巢式PCR和多重PCR,巢式PCR中外侧引物和内侧引物有一定关联但不完全相同,两次PCR模板不同,有先后顺序。多重PCR是一次性在缓冲液中加入多对引物对同一DNA分子的不同片段进行扩增。当需要对多个目的基因进行高精度扩增时,可同时采用多重PCR和巢式PCR。

5.实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR建立在早期逆转录PCR的基础上。早期的逆转录PCR通过对mRNA逆转录形成的产物进行电泳,观察电泳带的亮度来衡量mRNA的量,但由于亮度极差很难区分,且扩增效率达不到100%,因此检测结果误差大。

在此基础上,科学家开始探索检测每一轮PCR产物的累计数量,荧光定量检测技术应运而生。这种技术通过荧光标记的方式,对PCR产物进行标记跟踪,结合电脑软件对每轮产物进行分析,从而精确计算待测样品的初始模板量。目前荧光标记的方式比较多,但高中生物学试题常考的是水解探针(TaqMan探针)标记,以下题为例作重点介绍:

例4.实时荧光定量PCR(QPCR)实现了PCR从定性到定量的飞跃。TaqMan探针是QPCR技术中一种常用探针,图3为TaqMan荧光探针及其作用原理示意图:

正向引物:GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为A,加入B个模板DNA分子(目的基因),通过QPCR进行扩增。反应体系中荧光信号强度(Rn)与扩增次数(n)之间的关系:Rn=________。

答案：AB×(2n-1)

此类题目多对知识背景进行了简化。这里补充一个知识:Taq酶不仅具有DNA聚合酶的性质,还兼有5′-3′外切酶的活性,在延伸到探针附近时,能将其5′端切离。

6.不对称PCR

前五种PCR,加入的均为相向配制的成对引物,如果在反应体系中只加入一种引物,就只能扩增目的基因的一条链,这种扩增方式称为不对称PCR。这种PCR的主要目的就是让需要研究的模板链含量迅速增加,常用于DNA单链的测序以及定点突变的检测。在实际操作过程中,为了让模板链的基数增加,也可以加一对引物,但两种引物的浓度差异较大,使得一条链的扩增速度远大于另一条,体现了不对称的本质。以一道模拟题为例:

例5.不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物,在PCR反应的最初10～15个循环中,其扩增产物最初主要是双链DNA,但当限制性引物消耗完后,非限制性引物引导的PCR就会产生大量单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA,最初10个循环扩增产生双链DNA,后20个循环均只扩增一条链,则需要限制性引物________个。因为双链DNA和单链DNA的________不同,可通过________将其分离。

答案：(210-1)a相对分子质量(碱基数量) 电泳法

需要注意的是在不对称PCR中,限制性引物与非限制性引物的最佳比例与模板链本身、引物的类型和长度等因素都有密切的关系,需要多次摸索和优化。

7.结语

本文所列六类扩增技术在高中生物学考题中出现的频率相对较高,随着新高考试题对情境挖掘的深度和力度加大,以其他PCR技术为背景的考题肯定会陆续出现。

此外,各种PCR技术不是孤立的,它们均以常规PCR为基础,为实现特定目的而进行了一定改进,但也有各自的局限性,因此在必要时可同时使用几种扩增技术,如多重巢式PCR、反向实时荧光定量PCR等。

在高考备考中,要关注不同扩增技术的本质差异,同时总结此类试题的解答步骤:一是寻找题图有效信息,确定所考PCR类型;二是迅速再忆所考PCR的独特性,猜测出题人可能的意图;三是根据设问对前述猜测进行验证,并领悟出题人挖掘的新考点,进而对知识框架进行完善。