食品中常见病原微生物的检验

张姣

食品安全问题是重要的社会健康问题。食品安全性、食品营养性和食品感官要求是食品质量的基本要素。“民以食为天，食以安为先”突出了食品安全的重要性。食品质量安全的检验需要从实际出发，运用严谨、科学、有效的方法。尤其是食品微生物检验，需从食品生产的工艺环节入手，联系“人、机、料、法、环”五要素，从生产人员、生产设备、原辅料、包装材料、制备方法、生产储存环境多方面入手，完成食品微生物检验指标：菌落总数、大肠菌群、病原微生物（致病菌）、霉菌及其毒素。其中病原微生物检验是食品微生物检验的重要内容。本文将从质量安全入手，阐述如何从技术层面确保食品受病原微生物污染情况在可控范围内，从而确保食品质量安全。

现代食品必须具备三个基本要求，即“安全性”、“营养性”和“感官要求”。“民以食为天，食以安为先”突出了食品安全的重要性。因此，对食品进行微生物学检验尤其重要，成为食品检测必不可少的重要组成部分。食品微生物学检验的指标包括：菌落总数、大肠菌群、病原微生物（致病菌）、霉菌及其毒素，其中病原微生物检验是食品微生物检验的重要内容。其中部分病原性微生物可通过食品被污染或通过细菌的代谢产物-大量毒素，引起的食物中毒，该种中毒常以急性过程为主要特征，称为细菌性食物中毒，在食物中毒原因中，排列第一。以动物为食品原料的食品最常见，具有季节性明显，以夏秋季发病率最高，病死率因中毒病原而异，常见为肠道致病菌等特点。本文将针对食品中常见病原微生物，从生物学概述、检验方法、结果与报告几方面对其进行探讨。

1.沙门菌检验

1.1生物学概述

沙门菌属是寄生于恒温动物肠道，一大群生化反应相似的革兰阴性杆菌。需氧、无芽孢、有鞭毛，有运动能力，能有规律地发酵葡萄糖并产酸产气。

沙门菌属种类繁多，少数只对人致病。可导致人类疾病有伤寒、副伤寒、集体或单发性食物中毒。在细菌引起食物中毒案例中，由沙门菌导致的食物中毒常是第一或第二原因。

食品中沙门菌的定性检验方法有五个步骤：前增菌（非选择性增菌）→选择性增菌→平板分离→生化试验鉴定到属→血清学分型鉴定。

目前食品中的沙门菌检查方法为GB4789.4-2016，报告25g/mL食品中是否检出沙门菌。

1.2检验方法

1.2.1前增菌

称取25g（mL）样品放入盛有225 mLBPW中，注意不能均匀分布于稀释液的样品需用无菌均质杯/均质袋或匀浆仪，以8000-10000转/分的速度，均质1-2分钟，即保证样品中微生物均匀分布于BPW中。若样品为液态，则振荡混匀即可。于36±1℃培养8-18小时。

如为冷冻产品，需提前解冻。条件为45℃以下，不超过15分钟。

1.2.2选择性增菌

经过前增菌，食品中微生物均大量繁殖，包括除沙门菌和其他种类微生物均迅速繁殖。但沙门菌往往是食品所含细菌中的一小类，沙门菌外大量其他菌群甚至会干扰沙门菌的检出。故为了排除非沙门菌菌群干扰，需要对前增菌的培养液做选择性增菌。方法为：轻轻摇动前增菌的培养液，无菌吸管取1mL，转种有10mLTTB的无菌试管内，于（42±1）℃培养18-24小时。同时，另取1mL，转种于有10mLSC的无菌试管内，于（36±1） ℃培养18-24小时。TTB和SC均为选择性增菌液，只适合沙门菌生长繁殖。

1.2.3选择性平板分离

经过选择性增菌，如TTB和SC培养液由澄清变为浑浊，则说明培养液中大概率有沙门菌生长繁殖。此时分别用接种环移取浑浊的SC增菌液和TTB增菌液，分别划线接种于下列选择性平板： BS、XLD、HE、沙门菌属显色培养基平板。其中，BS为必选平板，XLD、HE、沙门菌属显色培养基平板可任选其一。四种平板培养基均为沙门菌鉴别培养基。置于（36±1）℃培养，所有平板中，除BS琼脂平板培养40-48小时，其余平板培养18-24小时。观察培养结果，如各个平板上无菌落生长则判断为阴性，无需进一步实验；如各个平板上有菌落生长，则根据沙门菌在各鉴别培养基平板上的菌落特征，进行是否污染菌为沙门菌的初步判断。

1.2.4生化试验

生化试验所用培养基为三糖铁琼脂培养基、赖氨酸脱羧酶培养基，接种菌落至营养琼脂平板的目的为分离纯化，为血清学分型鉴定做准备。在生化试验中，沙门菌属的反应结果应与相应结果符合。

1.2.5血清学分型鉴定

符合上述生化反应特征者，用沙门菌多价血清进行鉴定。若血清凝聚，则诊断为该种沙门菌。

1.3结果与报告

结果报告描述为：25g或25mL样品中检出或未检出沙门菌。

2.金黄色葡萄球菌

2.1生物学概述

葡萄球菌广泛分布于自然界中，大多数是非致病菌，少数有致病性，能引起人和动物各种化脓性疾病和葡萄球菌病，是临床上常见的呼吸道、消化道致病菌。食品受到葡萄球菌的污染，在适宜条件下，能产生肠毒素，引发食物中毒。

2.1.1形态及染色

典型的金黄色葡萄球菌为球型，无芽孢、鞭毛，呈葡萄串状分散排列，故涂片时切勿涂片太厚。革兰染色阳性。

2.1.2培养特性

金黄色葡萄球菌营养要求低，需氧、兼性厌氧条件均可生长。有高度的耐盐性，在10%-15%NaCl肉汤（高盐肉汤）中生长良好。

在血琼脂平板上形成的菌落较大，菌落周围形成β溶血环。在Baird-Parker平板上生长时，菌落呈较小灰黑色，在其外层因产生蛋白水解酶有一透明带。

2.1.3生化特性

分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。致病菌株能液化明胶，在厌氧条件下分解甘露醇，产酸，不产生靛基质。

2.2定性检验方法

2.2.1样品处理

利用金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性的特征。方法如下：称取25g（mL）样品放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤中，注意不能均匀分布于稀释液的样品需用无菌均质杯/均质袋或匀浆仪，以8000-10000转/分的速度，均质1-2分钟，即保证样品中微生物均匀分布于7.5%氯化钠肉汤中。若样品为液态，则混匀即可。

2.2.2增菌和分离培养

将上述样品匀液于（36±1）℃培养18-24小时。金黄色葡萄球菌因其高度耐盐性，在含有7.5%氯化钠的肉汤（高盐环境）中应旺盛生长，培养基应呈浑浊。故如高盐培养液由澄清变为浑浊，则说明培养液中有金黄色葡萄球菌生长繁殖，但仍需根据培养特性做进一步检验：

将上述培养物，划线接种到Baird-Parker平板，（36±1）℃培養24-48小时。同时将上述培养物划线接种到血平板，（36±1）℃培养18-24小时。

金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上菌落较小，颜色呈较小灰黑色。在血平板上，形成圆形、有β溶血环的较大菌落。上述实验结果基本可判定样品中有金黄色葡萄球菌，但食品微生物检测的严谨性决定检验结果需进一步检定，故挑取上述菌落进行染色镜检和血浆凝固酶试验。

2.2.3鉴定

2.2.3.1革兰氏染色法染色镜检

结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→沙黄复染。原理如下：

结晶紫作为初染液先将所有细菌染成紫色，染色时间1分钟。由于菌体和染液结合不够紧密，故碘液作为媒染液，使菌体和结晶紫结合更加紧密，不易被乙醇脱色，染色时间1分钟。乙醇脱色（30秒）步骤开始，菌体颜色出现分化：革兰氏阳性菌因为细胞壁厚，初染液结晶紫被牢固的保存于菌体内，使细菌保持紫色；革兰氏阴性菌因为细胞壁薄，初染液结晶紫很容易被脱色液乙醇洗脱，故使菌体呈现无色。最后复染液沙黄作用于菌体，革兰氏阳性菌依然保持紫色；革兰氏阴性菌被染成红色，染色时间1分钟。

金黄色葡萄球菌染色结果为红色革兰阳性菌，球形，排列呈葡萄球状。

2.2.3.2血浆凝固酶试验

挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落，进行血浆凝固酶试验。

2.2.4结果判定

在血平板、Baird-Parker平板的菌落特征、镜检结果均符合金黄色葡萄球菌的特征，血浆凝固酶试验阳性结果，可判为金黄色葡萄球菌阳性。结果报告描述为：25g或25mL样品中检出或未检出沙门菌。